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实验二、各种生物装片的制作一.目的与要求1、熟练掌握各种生物装片的制作。找同学边讲解边演示各种生物装片的制作过程2、学会指导学生制作其装片3、找同学讲解生物绘图的要求并让学生初步掌握生物绘图的基本方法。二.材料和用具HB及2H或3H绘图铅笔、橡皮、直尺、绘图纸、铅笔刀、载玻片，盖玻片、土豆、洋葱、显微镜。三.实验步骤(一).生物绘图找同学讲解生物绘图的要求和方法要求1.具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。2.图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。3.绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。4.绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。5.绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。6.绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。方法生物绘图的方法有多种，最长见的是点点衬阴法。点点衬阴法即将图形画出后，用铅笔点出圆点，以表示明暗和深浅，给予立体感。在暗处点要密，明处要疏，但要求点要均匀，点点要从明处点起，一行行交互着点，物体上的斑纹描出再点点衬阴，点点衬阴法要求不能用涂抹阴影的方法以代替点点，此点初学者要尤为注意。（二）徒手切片法（同学讲解并演示）用光学显微镜观察的样品必须是透明的薄片，因此，要先把观察的材料制成透明的切片后，才能在显微镜下观察。徒手切片方法是观察植物内部构造的方法，徒手切片的重要工具是双面刀片，每次用后必须擦干净，注意保护，以免生锈。徒手切片的过程如下：1、材料的选择:一般选用软硬适度的植物根，茎或叶等，材料不宜太硬也不太软。切较软的材料时，可用马铃薯、胡萝卜根或肥皂将欲切的材料夹住；一起进行切片。有些叶片亦可卷成筒状再进行切片。欲切之材料应先截成适当的段块，并削平切面，一般截面的大小以不超过3-5mm2为宜，长度2-3cm，较便于手持并进行切片。2、方法和步骤：（1）.切片前，在小培养皿中盛以清水，准备好毛笔，滴管和刀片等用具和欲切的材料。（2）.切片时用左手的三个指头拿住材料，并使材料稍突出在手指上，以免刀口损伤手指。右手持双面刀片，把刀刃放在经过削平的平面上，轻轻压住它，刀口向内，且与材料断面平行，然后以均匀的力量和平稳的动作，自左前方向右后方滑行切片，注意要用整个手臂向后拉（手腕不必用力）。切片时动作要敏捷，材料要一次切下（整个过程中应用清水湿润材料和刀面，使之润滑，否则材料容易破损）。如此连续动作，切下许多薄片后，就用湿毛笔将这些薄片轻轻移入已盛水的培养皿中备用。徒手切片时最重要的是切下一小片平而薄的组织，而并不要求切下一个完整的切片。（3）.用毛笔挑选最薄而透明的切片，取出放在载玻片上，制成临时装片观察；如标本有保留价值，则可再进行以下处理，制成永久标本。A、将切片移入小烧杯中，经50％、60％、70％各级乙醇中进行脱水及固定，每级5分钟，然后移入1％番红染液中（用70％乙醇溶液配制）中30分钟。B、继续移入80％、90％、95％各级乙醇脱水，每级5分钟。再移入1％固绿染液（用95％乙醇配制）染色30分钟，再入95％乙醇中洗去浮色，最后进入无水乙醇脱水5分钟。C、切片置于无水乙醇:二甲苯＝1：1的溶液中5分钟，再移入纯二甲苯中5分钟，此时组织切片呈透明状态。D、将切片置于载玻片中央，加一滴树胶，盖上盖玻片封片，待干燥后即可使用。徒手制片的应用和主要特点徒手制片（徒手切片）一般指徒手用刀片（常用单面刀片）把新鲜的植物材料切成薄片的制片方法。此法在植物制片中具有十分重要的地位，是一种普遍应用的制片方法。比如在研究花芽分化、新梢、新根及叶片等解剖构造以及贮藏营养等方面时，常采用徒手切片法。此外，在进行植物组织显微化学鉴定以及制作永久制片之前，也经常先用徒手切片进行观察，以检查材料是否合乎要求而决定取舍。因此徒手制片技术是科研人员必须学习和掌握的基本技术之一。徒手制片的主要优点是：（1）能及时观察研究植物生活组织的结构和天然色彩；（2）方法及用具简单，不需切片机等机械设备，短时间即可完成，这是其他方法所不及的；主要缺点是（3）对于微小、柔软、水分过多以及坚硬的材料，难以用徒手切成薄片；（4）对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀或不完整的切片。徒手制片的方法和注意事项徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单面保安刀片。要获得良好的切片，首先要保持刀口的锋利，因此在进行材料的截取、削平切面时，可以用解剖刀或用过的刀片，不要用新刀，以免钝化刀口。切片前，先准备好一个培养皿盛好清水，同时准备好显微镜、载玻片、盖玻片、刀片等用具，然后拿取材料进行切片。材料可以是新鲜的材料，也可以是经过固定的材料（若材料取回后，因各种原因不能及时切片，可将材料保存在F.A.A固定液中，而后可随取随做切片）。切片时，将欲切材料断面和刀片上滴上清水以保持材料湿润（整个切片过程中均应用清水润湿材料和刀面，以减小切片时材料与刀片间的摩擦力）。以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指应低于食指，以免切伤手指；材料高出指尖（不要高出太多，否则不易掌握切片厚薄）。右手执刀，将刀平放在食指上，刀口朝内，刀面与材料断面平行，然后以均匀快捷的动作自左前方向右后方以臂力带动刀片水平切割移动（不要用腕力）。切片时还要注意：两只手要能自由活动而不要靠在身上或桌子上；切实动作要迅速，材料一次切下，切忌停顿或拉锯式切割。连续切数片后，用湿毛笔将切下的薄片轻轻移入盛水的培养皿中（或将刀片在培养皿水中稍一晃动，切片即可飘落于水中）备用。做连续徒手切片时，会因用力不均或刀不锋利而出现切面倾斜的现象，要及时修正。然后用镊子或毛笔在培养皿中挑选薄而透明的切片（形状不要求非常完整），放在载玻片上的水滴中，加上盖玻片制成临时制片进行观察。在加盖玻片时，要使盖玻片的一侧边缘与水滴边缘接触，然后慢慢向下放盖玻片，若盖玻片下有气泡应重新放置盖玻片。要区分气泡和细胞结构的差别，气泡呈圆形，中间亮，边缘是黑圈，而且随着显微镜调焦的变化黑圈大小也随之变化。用徒手切片的材料不宜过大，一般以表面不超过5~8mm²为宜。对于过于柔软或微小的材料（如叶片、细小的根尖等），难以用手拿住来做切片，需要借助一些夹持物方可进行切片，一般可采用马铃薯块茎或胡萝卜直根（将中间硬心切去）作夹持物。先把夹持物切一纵向切口，然后把材料夹于夹持物中，然后进行徒手切片。夹持物的大小、夹缝（甚至夹沟）等应视材料具体情况而定。另外，像观察植物表皮结构，可以不用切片，撕取表皮后制成临时装片观察。如果临时制片需保存一段时间，（1）将材料封在水中，每隔20~30分钟再加一滴水，此法可保持数小时；（2）用10%~30%的甘油水溶液代替清水封片，并将制片放在铺有湿滤纸的大培养皿中保存，或用石蜡或指甲油封边保存，可保存1~2周或更长时间。总之对于徒手制片来说，在正确掌握操作的基础上，反复训练，最终可以使徒手切片达到薄、正、精美的程度。（三）临时装片的制作（同学讲解并演示）背景知识1.玻片标本类型：按照制作标本可保存的时间长短，可分为两类。（1）临时玻片标本：是实验中观察标本常采用的方法，保存时间不长久是本法的缺点。如：草履虫形态及应激性、口腔上皮细胞、植物细胞质壁分离及复原、洋葱根尖有丝分裂、病原体观察等。（2）永久玻片标本：如洋葱根尖固定装片、蛔虫受精卵固定装片等。2.制片法：中学常用的四种制片法是:石蜡切片法（如制作植物茎横断面的切片）；涂片法（制作衣藻、细菌、原生动物、酵母菌口腔上皮细胞临时装片）；压片法（植物幼根根尖有丝分裂、洋葱根尖有丝分裂、蚕豆根尖有丝分裂、早期花蕾观察花粉母细胞、蝌蚪尾部细胞有丝分裂、双翅目幼虫唾液腺染色体、洋葱鳞片叶表皮等临时装片的制作）；徒手切片法（如双子叶植物夹叶桃、桂花叶片横切及木本植物大叶黄杨茎的横切）。制作洋葱表皮细胞临时装片实验用品滴管、纱布、镊子、吸水纸、载玻片、盖玻片、清水、刀片、染液（碘液）实验材料洋葱表皮细胞、其他感兴趣的生物材料实验步骤1．擦拭载玻片、盖玻片2、在载玻片的中央滴一滴清水3．在洋葱内表皮用刀片划出一个约1cm2的正方形（在使用刀片时注意安全），用镊子撕取洋葱内表皮4．将内表皮置于载玻片的清水中，并使之铺开5．从一侧开始慢慢盖上盖玻片，不能有气泡产生6．在盖玻片的一侧滴一滴染液7．然后用吸水纸从另一侧吸取多余的染液，使洋葱表皮细胞均匀染色8．显微镜下观察.染色后的洋葱细胞(示细胞核)（图）“擦、滴、撕、展，盖、滴、吸染”的临时装片制作顺口溜制作人的口腔上皮细胞临时装片时的前四个步骤可简单记作：一漱、二擦，三滴、四刮等顺口溜。改进霉菌临时装片制法霉菌临时装片的制法没作介绍，教参上的制法又不很实用。为此，在对实验进行不断摸索、探讨后，对霉菌临时装片的制作方法进行了改进。改良后的方法步骤如下：经改进的实验步骤简单明了，学生一学就会，一次成功率可达80%，其余学生重做后即可成功。（1）在载玻片中央滴一滴清水。（2）用解剖针或解剖剪取少许培养好的霉菌，放入载玻片上的清水中。（3）盖上盖玻片。（4）用解剖针轻压并敲击盖玻片。（5）把临时装片竖着稍倾斜，用滴管吸清水从盖玻片一侧小心冲洗霉菌。（6）重复4、5两步，直到装片内的霉菌呈薄雾状。（7）擦干临时装片周围的水分，临时装片即制好。用上述方法制作的临时装片，因经过“敲击”，霉菌被分散，克服了菌丝大量重叠的缺点，又进行了“冲洗”，散落的孢子大多被冲走，避免了孢子太多，遮盖菌丝的情况。所以镜检时，霉菌的菌丝分布均匀、孢子梗清楚，无论是青霉的扫帚状结构，还是曲霉的球形放射状结构都清晰可辨。（四）水螅整体装片的制作实验前的思考整体装片制作法，可以用于封固小形动、植物的整个身体，或个别组织和器官，所需的仪器、药品及方法都比较简单，制成永久装片后能长期保存。材料器具水螅；玻璃缸，表面皿，吸管；70%无水乙醇，氨水，1%盐酸，二甲苯，波因（Bouin）氏固定液，硼砂洋红染液。步骤1．波因氏固定液的配制75毫升苦味酸饱和水溶液中加入25毫升甲醛，在临用时再加入5毫升冰乙酸。2．固定固定水螅时，先在表面皿里面放少量水，然后用吸管把水螅从培养缸中吸出，放在表面皿内。等水螅身体和触手慢慢伸展后，用加热的波因氏液（30～34℃）固定。固定液要多一些，倾倒时要迅速，也可用吸管吸取加热的波因氏液浇射在水螅上，浇射的方向必须从基部到触手端，浇射的时间必须极短，不要把固定液滴入水内，这样水螅才不至于收缩。在波因氏固定液中固定4～8小时。3．浸入70%乙醇中，每天更换一次70%乙醇，直到洗去标本上因固定液而染上苦味酸的黄色为止。如果需要快一些去色，可以加1～2滴氨水。如果使用氨水去色，则在黄色除去后，仍应该换两次70％乙醇，以除去氨水的碱性。4．染色浸入硼砂洋红染液（配制方法参见本书第836页）中，染24小时。5．褪色用1%盐酸乙醇褪色，时间为0．5～1分钟，褪到内部器官能看清楚为止。6．脱水依次浸入70％乙醇、80%乙醇、95%乙醇及无水乙醇。7．透明用二甲苯透明。中途更换一次新液，至透明为止。8．封片用树胶封片，树胶可以浓一些。注意事项1．制作水螅整体装片最重要的步骤是固定，如果这一步骤处理不好，水螅的触手和身体都会收缩，制成的标本就不能使用，所以采取有效的方法来固定是成功的关键。2.在制作水螅装片时要非常小心，稍不注意就会弄碎或折断触手，特别在二甲苯中更容易弄碎或折断，所以在整个制作过程中，尽可能少用镊子夹镊，也不宜多次更换盛器，最好只换溶液（如乙醇、二甲苯）不换盛器3．褪色时，标本不能在盐酸乙醇中停留过久，否则颜色会全部褪尽。作业指导学生制作徒手切片和临时装片应注意哪些问题？