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实验六—实验八微生物的分离与纯化微生物培养特征的观察微生物的平板菌落计数法一.实验目的及要求1.了解微生物分离和纯化的原理2.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术，掌握微生物的无菌操作技术。3.了解不同的微生物在固体培养基上的生长特征4.学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法二.实验原理(一)微生物的分离纯化微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。上述工作又离不开接种，即将一种微生物移接到另一灭菌培养基上的过程。分离纯化常用的方法有：（1）简易单细胞挑取法（2）平板分离法选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。（二）微生物培养特征的观察1、微生物的培养特征是指微生物在固体培养基、半固体和液体培养基中生长后所表现的群体形态特征。2、不同的微生物具有不同的培养特征，这些特征一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。3、固体培养基又分为平板和斜面两种。不同来源的样品接种于平板培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内会形成菌落。4、每一种细菌所形成的菌落有它自己的特点，如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。5、可通过平板培养来检测不同的材料中微生物的数量和类型（三）微生物的平板菌落计数平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，即一个菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数三.材料仪器牛肉膏蛋白胨培养基、土豆培养基、油脂培养基、淀粉培养基、移液管、三角瓶、无菌水、接种环、酒精灯、土壤悬液、无菌培养皿、涂棒、恒温培养箱等。四.实验内容及方法1.采集土样，制备土壤悬液：1g土稀释到10-6；称取5克土样放入装有45ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，连续摇动30分钟，依次稀释至10-6倒平板→划线→培养→挑单菌落→接种移植→保存2.倒平板:右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。3.涂布分离将0.2m菌悬液小心的滴在平板培养基表面位置。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边沿处可改变方向用涂棒再涂布几次。培养后可观察有无孤立菌落生长，每一孤立菌落即为一纯种细菌。一般病原菌的菌落数少于杂菌，故在分离培养时，应力求出现较多的孤立菌落，以提高病原菌检出率。4.恒温培养箱培养土豆培养基板于28℃倒置培养24天，牛肉膏蛋白胨培养基、土豆培养基、油脂培养基、淀粉培养基于37℃倒置培养24小时后观察5.观察并记录菌落形态6.计算同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算:每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5作业1.在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。2.如何确定平板上某个菌落是否为纯培养？请写出试验的主要步骤。3.如果一项科学研究内容许从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案。