实验六人参中人参皂苷的提取分离及鉴定

1实验六人参中人参皂苷的提取分离及鉴定人参为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根，是传统名贵中药，始载于我国第一部本草专著《神农本草经》。其栽培者称为“园参”，野生者称为“山参”。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功能，用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷、心力衰竭、心源性休克等的治疗。人参的化学成分很复杂，有皂苷、挥发油、糖类及维生素等。经现代医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分，它具有人参的主要生理活性。人参的根、茎、叶、花及果实中均含有多种人参皂苷(ginsenosides)。到目前为止，文献报道从人参根及其它部位已分离确定化学结构的人参皂苷有人参皂苷-Ro、-Ra1、-Ra2、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2及-Rh3等50余种人参皂苷。根据皂苷元的结构可分为A、B、C三种类型：①人参二醇型-A型，②人参三醇型-B型，③齐墩果酸型-C型。A型和B型皂苷均属四环三萜皂苷，其皂苷元为达马烷型四环三萜，A型皂甙元称为20(S)-原人参二醇[20（S）-protopanaxadiol]。B型皂甙元称为20(S)-原人参三醇[20（S）-protopanaxatriol]。C型皂苷则是齐墩果烷型五环三萜的衍生物，其皂苷元是齐墩果酸(oleanolicacid)。2[目的要求]1.通过实验进一步掌握三萜类化合物的理化性质及提取、分离和检识方法。2.学习和掌握简单回流提取法、两相溶剂萃取法、旋转蒸发器、大孔树脂柱色谱等基本实验操作技能。[实验原理]人参的主要成分为人参皂苷，总皂苷含量约4％，人参皂苷大多数是白色无定形粉末或无色结晶，味微甘苦，具有吸湿性。人参皂苷易溶于水，甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙酯，不溶于乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。水溶液经振摇后可产生大量的泡沫。人参总皂苷无溶血作用，分离后，B型和c型人参皂苷有显著的溶血作用，而A型人参皂苷有抗溶血作用。人参中除含有皂苷外，还含有脂溶性成分如挥发油，脂肪、甾体3化合物及大量的糖类等，这些类成分对人参皂苷的分离和精制有干扰，所以必须除去，方可得到纯度较高的皂苷。本实验以人参根为原料提取分离人参总皂苷，利用人参总皂苷易溶于甲醇，不溶于乙醚性质采用溶剂法进行初步提取去杂；然后根据皂苷在含水丁醇中有较好的溶解度的性质采用萃取法进行分离；再用沉淀法或大孔吸附树脂法进行进一步分离精制；对提出的总皂苷采用检测三萜类化合物通性的理化检识方法——泡沫试验及显色反应进行初步定性检识；最后根据人参总皂苷中各单体皂苷分子结构中糖基个数和羟基数不同而极性大小不同的性质，通过薄层色谱法对人参总皂苷进一步分离和专属定性检识。[实验内容]一、人参总皂苷的提取分离任选一种方案方案(1)人参根粗粉（60目10g）用滤纸筒包好，置索氏提取器中，加甲醇加热回流提取至三氯化锑氯仿饱和溶液反应呈阴性，提取液减压回收甲醇浸膏用10倍量蒸馏水溶解水溶液用乙醚在分液漏斗中，振摇脱脂4次乙醚液（脂类）水层用水饱和的正丁醇萃取6次，合并正丁醇液减压回收正丁醇，蒸干4残留物（总皂苷粗品）方案(2)人参根粗粉（60目10g）用滤纸筒包好，置索氏提取器中，加10倍量乙醚回流脱脂至无色，乙醚液（脂类）残渣加甲醇加热回流提取至三氯化锑氯仿饱和溶液反应呈阴性甲醇提取液减压回收甲醇浸膏用10倍量蒸馏水溶解水溶液用水饱和的正丁醇萃取6次，合并正丁醇液减压回收正丁醇，蒸干残留物（总皂苷粗品）二、人参总皂苷的分离精制将人参总皂苷粗品分为两份方法（1）沉淀法1份总皂苷粗品甲醇溶解，倾入约10倍量丙酮，不断搅拌，析出黄白色沉淀母液过滤回收溶剂，用少量甲醇溶解，再倾入约10倍量丙酮总皂苷黄白色沉淀过滤总皂苷合并，减压60℃下真空干燥，称重计算收率精制总皂苷方法（2）大孔树脂柱色谱法大孔树脂色谱是近年来用于分离和富集天然化合物的一种常用5方法，应用大孔树脂分离皂苷，主要用于皂苷的富集和初步分离。将含有皂苷的水溶液通过大孔树脂柱吸附后，先用水洗脱除去糖和其他水溶性杂质，然后改用不同浓度的甲醇或乙醇进行梯度洗脱。极性大的皂苷可被低浓度的甲醇或乙醇洗脱下来，极性小的皂苷则被高浓度的甲醇或乙醇洗脱下来。1份总皂苷粗品用少量水溶解，加样于处理好的D101型大孔树脂柱上，吸附1小时后，用3倍柱体积蒸馏水洗脱除杂质继用60%乙醇洗脱至三氯化锑氯仿饱和溶液反应呈阴性洗脱液减压回收溶剂残留物减压60℃下真空干燥，称重计算收率精制总皂苷三、人参皂苷的鉴定（一）理化检识1．泡沫试验取人参根粗粉1g，加水浸泡（1：10）1小时或置80℃水浴上温浸30分钟，过滤得滤液供以下试验。取供试液2ml于试管中，紧塞试管口后猛力振摇，试管内液体则产生大量的持久性的似蜂窝状泡沫（示有皂苷）。注：含蛋白质和粘液质的水溶液虽也能产生泡沫，但不持久，放置很快消失。2.显色反应（1）醋酐－浓硫酸反应（Liebermann-Burchard反应）取样品适量，加冰醋酸0.5ml使溶解，续加醋酐0.5ml搅匀，再于溶液的边沿滴加1滴浓硫酸，观察并记录现象。（2）三氯甲烷－浓硫酸反应（Salkowski反应）取样品适量，加三氯甲烷1ml使溶解，沿试管壁加等量的浓硫酸，分别置可见光及紫外灯下，观察并记录现象。6（3）五氯化锑反应（Kahlenbergreaction）取样品适量，加五氯化锑的氯仿溶液反应呈紫色。或将样品的氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷20％五氯化锑的氯仿溶液(或不含乙醇和水的三氯化锑饱和的氯仿溶液)，干燥后60℃~70℃加热，显色，观察并记录现象。(二)色谱检识1.薄层色谱吸附剂：硅胶-CMC薄层板样品溶液：称取由沉淀法及大孔吸附树脂法制得的精制总皂苷各一份，加甲醇制成1ml含2mg的样品溶液。对照品溶液：称取人参皂苷Rb1、Re、Rg1对照品，加甲醇制成1ml含2mg的对照品混合溶液。对照药材溶液：取人参对照药材粉末1g，加氯仿40ml，置水浴上回流1小时，弃去氯仿液，药渣挥干残存溶剂，加水0.5ml拌匀湿润后，加水饱和的正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液，加氨试液三倍量，摇匀，放置分层，取上层液蒸干加甲醇溶解，使成1ml，作为对照药材溶液。展开剂：A.氯仿-甲醇-水(65：35：10)10℃以下放置后的下层溶液;B.氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置后的下层溶液;显色剂：10%硫酸乙醇溶液显色方式：10%硫酸乙醇溶液喷雾后，105℃加热至斑点显色清晰。分别置日光及紫外灯(365nm)下检视.7[实验说明及注意事项]1．萃取操作时，注意振摇不能过度剧烈，以防产生乳化现象。2．在使用旋转蒸发器进行甲醇提取液减压浓缩时，因含皂苷易产生大量泡沫发生倒吸现象。故应注意观察随时调整水浴温度及旋转蒸发器转速，避免事故的发生。3．在连续回流提取过程中，水浴温度不宜过高，应与溶剂沸点相适应。此外可加快冷凝水的流速，以增加冷凝效果。4．回收乙醚的蒸馏操作，不必另换蒸馏装置。只将索氏提取器中的滤纸筒取出，再照原样装好，继续加热回收烧瓶中的溶剂，待溶剂液面增加至高虹吸管顶部弯曲处1cm处，暂停回收，取下提取器，将其中乙醚移置另外容器中，如此反复操作，即可完成回收乙醚的操作。5．在连续提取过程中，欲检查有效成分是否提取完全，可取提取器中提取液数滴，滴于白瓷皿中，挥散溶剂，观察有无残留物，或滴于滤纸片上，然后进行醋酐－浓硫酸反应或三氯化锑氯仿饱和溶液反应。若反应呈阴性，示已提尽。6．大孔树脂在使用前应按说明书处理好，加乙醇浸泡24h后，再用乙醇洗脱至流出液与3倍水混合后不呈混浊，继续用蒸馏水洗至无醇为止备用。[思考题]1．三萜皂苷可用哪些反应进行鉴定？如何与甾体皂苷区别？2．试设计一种从人参茎叶为原料提取分离人参总皂苷的工艺流程，并说明提取、分离原理。3．使用乙醚作提取溶剂时，操作中应注意哪些事项？附：[实验预习要求]1．根据实验目的要求归纳总结实验原理，明确实验原理。2．根据本次实验流程列出实验所需试剂、试药，仪器及装置。明8确实验需要试剂及仪器，掌握提取装置原理、组成及安装）。3．解析提取工艺流程。4．掌握提取分离过程操作要点。5．推测实验现象及结果。