实验六地锦草黄酮的提取及其药敏实验

地锦草黄酮的提取及其药敏实验地锦草(HumifuseEuphorbaiaHerb)别名血见悉、红丝草、奶疳草、奶浆草。来源为大戟科植物地棉EuphorbiahumifusaWilld.的地上部分。植物形态一年生葡萄草本，有白色乳汁。茎纤细，近基部分枝，带紫红色，无毛。叶对生，长圆形，长4～10mm，宽4～6mm，先端钝圆，基部偏斜，边缘有细齿，绿色或带红色，两面无毛或疏生柔毛。种子卵形，黑褐色，外被白色蜡粉。花期7～10月，果实7月后渐次成熟。生于平原荒地、路边、田间。除广东、广西外，全国各地均产。采制夏、秋季采收，除去杂质，晒干。图1地锦草植株形态一、实验原理（一）地锦草黄酮的提取黄酮是地锦草的主要有效成分之一，具有三环苯基苯并吡喃结构的呈色化合物。黄酮类化合物均可溶于乙醇，而超声波的超声空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断振荡，有助于溶质的扩散，提高了有效成份的提取率以及原料的利用率。本实验将传统的回流提取法结合超声波法提取地锦草黄酮。（二）地锦草黄酮的纯化利用D-101大孔树脂的吸附与筛选原理，经一定的溶剂洗脱不同分子量的化合物，从而得到分离纯化，得到总黄酮。二、实验目的（一）掌握提取地锦草黄酮的方法；（二）掌握药敏实验的基本步骤。三、实验用仪器及材料实验仪器及设备旋转蒸发仪、电子天平、恒温水浴锅、恒温培养箱、超净工作台、超声波细胞粉碎仪、冷冻干燥机、圆底烧瓶、平皿、漏斗、烧杯等。实验对象及材料地锦草干燥粉末、80%乙醇、D-101大孔吸附树脂、牛肉浸膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠等。四、实验方法（一）地锦草黄酮的提取1.1粗提物的提取准确称取地锦草干燥粉末20g，80%的乙醇200ml超声25min，转移至500ml的圆底烧瓶，60℃加热回流2h，共回流2次，过滤，合并滤液，减压浓缩滤液，浓缩后加少量纯净水，于烧杯中静置过夜，离心除杂，取上清液。四、实验方法1.2粗提物的纯化将预处理的D-101大孔吸附树脂湿法装柱，先用95%的乙醇洗脱，再用蒸馏水洗脱，直至洗脱液无乙醇气味。取20ml粗提液，以2BV/h流速上柱，上柱完毕后静置吸附30min，吸附后先用蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，然后用75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，得地锦草总黄酮浸膏，浸膏冷冻干燥，称重。四、实验方法（二）地锦草黄酮的定性鉴定反应类型现象结果盐酸-镁粉反应溶液变桃红色可能存在黄酮类化合物铅盐沉淀反应红色沉淀可能存在黄酮类化合物三氯化铝反应黄色斑点可能存在黄酮类化合物与碱反应溶液变黄可能存在黄酮类化合物氨熏试验黄色斑点可能存在黄酮类化合物四、实验方法（三）供试菌液的制备所用菌株使用前将保存菌种先接种平板，于37℃培养24h后，挑选典型菌落接种于肉汤培养基中，再经37℃肉汤培养基培养18h后，以平板计数法测定其生长浊度，然后将菌液稀释至105—106个菌/ml备用。四、实验方法（四）抑菌效果的测定采用纸片法。将直径为6mm的灭菌滤纸片浸泡2h。干燥后用紫外线照射灭菌10-15min。用灭菌镊子将纸片放在含菌平板上，把每个处理过的培养皿放到37℃培养箱中培养。24h后用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小，并以此判断地锦草黄酮溶液对供试菌的抑制效果。抑菌效果判断标准为：D＜8mm为不敏感，8mm＜D≤13mm为低度敏感，13mm＜D≤19mm为中度敏感，D＞19mm为高度敏感。五、实验结果记录表（一）黄酮定性检测结果实验项目反应结果盐酸-镁粉反应铅盐沉淀反应三氯化铝反应与碱反应氨熏试验细菌青霉素（1.6万u/ml）链霉素（1.0万u/ml）磺氨嘧啶钠(10%)地锦草黄酮金葡菌沙门氏杆菌大肠杆菌实验结果记录：抑菌直径（mm）下一张主页退出上一张药物六、思考题黄酮的主要药理作用是什么？有何临床应用？黄酮的提取过程中应注意什么？