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实验十四酵母蔗糖酶分离、纯化、活力测定、电泳检测蔗糖酶的提取纯化一、实验目的和要求：了解离子交换层析的基本原理。掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。熟悉有关生化技术的操作方法。二、实验原理蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。因此，每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如Nelson比色法、斐林试剂法等。本实验用干酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶（invertase），并对其性质进行测定。采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，由此即可得蔗糖水解的速度。在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替使用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。蛋白质在分离纯化过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。三、实验的主要材料市售干酵母粉四、实验的主要试剂1、石英砂（助研磨作用）。2、95％乙醇（沉淀杂蛋白）。3.、DEAE—SepharoseFF(弱碱性阴离子交换剂，用于蛋白质分离)。4、20mmol/LpH7.3Tris-HCl缓冲溶液（简称buff，用以维持蔗糖酶液的最适pH。）5、0.5mol/LNaCl（调节溶液离子强度）。6、3，5-二硝基水杨酸试剂（作为还原糖显色剂）。甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。五、实验的主要仪器1．冷冻离心机2．研钵3．恒温水浴箱4．-20℃冰箱5．梯度混合器6．层析柱(1×20cm)六、实验操作流程干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—SepharoseFF柱→层析→活力检测七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处理一步外，尽可能低温）第一部分样品的制备：1.称取10.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂，10mlbuff（先量取总体积buff30ml），在研钵内研磨成糊状，约30分钟，再分次加buff10ml并研磨10分钟，,研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管，12000r/min离心10分钟，取上清液，并量取体积，留1.0ml上清液(定为第一步骤的样品Ⅰ)，用于测定酶活力和蛋白浓度。2.热处理将上步所得上清液转入50ml离心管，迅速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留1.0ml(Ⅱ样品)测定此酶活力和蛋白浓度。3.酒精沉淀将热处理后的上清液，加入相同体积的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！）放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的沉淀溶于7ml20mmol/LTris-HCl、pH7.3buff(Ⅲ样品，留1.0ml样液测活)，上样前用7ml离心管5000rpm离心10min，待上样。第二部分DEAE-SepharoseFF柱层析DEAE—SepharoseFF处理:（按说明书处理）取适量DEAE-SepharoseFastFlow，加入0.5mol/LNaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml0.5mol/LHCl,搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE-SepharoseFastFlow，用后务必回收）。浸入0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液中。DEAE-SepharoseFF柱预先用20mmol/LTris-HCl,pH7.3buff平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH与buff一致为准。上样后，用20mmol/LTris-HCl,pH7.3buff进行NaCl梯度洗脱(NaCl为0.5mol/L),层析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、20mmol/LTris-HCl,pH7.3缓冲液和50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/LNaCl。装柱(层析柱规格1×20cm)：装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积）20mmol/LTris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE—SepharoseFF轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约1-2cm后松开层析柱出口，控制流速0.5ml/min；待柱内DEAE—SepharoseFF自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的DEAE—Sephadex至距层析柱上端4cm处为止（这时须保持DEAE—SepharoseFF柱面平整）。用50ml20mmol/LTris-HCl、pH7.3的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。加样，洗脱：将平衡好的DEAE—SepharoseFF上端的水小心吸干，留下一薄层液面，用长滴管将样品液5ml，沿管壁环形慢慢加进柱内，待样品液全部进入DEAE—SepharoseFF内，只剩下一薄层液面时，用buff环形缓慢填满层析柱，立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装20mmol/LTris-HClpH7.3buff50ml，另一杯中装50mlbuff含0.5mol/LNaCl），打开洗脱杯控制开关，开动磁力搅拌器，用蠕动泵控制流速为3ml/15min。洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每6min收集一管(约3~4ml)。洗脱至混合器中液体流完为止，比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中，均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液(Ⅳ)测定酶活和蛋白量。(洗脱时，流速为0.5ml/分钟-1ml／分钟、4ml接收一管)酶活力检测：取试管若干支编号，各加入0.5mL5%蔗糖（pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺序分别加入上述含0.5mL5%的蔗糖的试管中混匀，置50℃水浴10min。再加入0.5mL3,5-二硝基水杨酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接目测。即可确定酶活力高峰范围。八、注意事项：1、离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。2、层析柱跟水平面要垂直。胶面要平，装柱时注意操作压；3、装柱用的树脂不能太浓也不能太稀；柱内不能有气泡,，不能干胶，不能有断层。流速不能过快。4、整个操作过程防止液面低于凝胶；清除管道内气泡。5、记录仪上zero勿动否则是一条直线。九、实验结果与分析附：仪器调节指标恒流泵流速：3ml/10min核酸蛋白自动检测仪A:0.2纪录仪V:20mv走纸速度：0.5mm/min自动收集器6min/tube共25tube上样量5ml装填平衡后的凝胶柱用肉眼观察应均匀，无纹路，无气泡。蔗糖酶活力及蛋白浓度的测定一、实验目的和要求掌握酶活力测定的方法；学会用Folin-酚法测定蛋白质的浓度；熟悉酶活力蛋白浓度的计算方法。二、实验原理蔗糖酶专一性地水解蔗糖为等量的葡萄糖和果糖。同时，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。本实验采用3.5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量与棕红色物质的颜色深浅成正比。因此可利用分光光度计进行比色测定，求得样品中的含糖量。本法操作简便、快速，杂质干扰较少。蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin—酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质含成正比。（Folin-酚乙试剂在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原成蓝色化合物）。蛋白质的Tyr和Trp还原磷钼酸—磷钨酸。干扰因素：酚类、柠檬酸；干扰双缩脲反应的基团；氨基酸或肽的缓冲剂。任何通过氮或碳原子把两个羰基连在一起的化合物都能产生阳性结果优缺点：操作简便，灵敏度高，可测范围25-250微克蛋白质。不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是直线形式。可测范围25—250ug蛋白质，而紫外的范围大200—2000ug。三、实验主要材料上一实验通过离子交换获得的蔗糖酶液。四、实验主要试剂1、3，5-二硝基水杨酸试剂：甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。2、1g/L葡萄糖3、5%蔗糖4、250ug/mL牛血清溶液(用Tris-HCl缓冲液配制)5、0.2mol/L乙酸缓冲液6、Folin-酚试剂A液：按下列比例：4％Na2CO3:0.2mol/LNaOH:2％酒石酸钾(钠)：1％CuSO4.5H2O=50:50:1:1(v/v)混合后一天有效。B液：在2L容积的磨口瓶中加入100g钨酸钠(Na2W),25g钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)及700ml水，50ml85％磷酸，100ml浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小火回流10h，回流结束，加入150g硫酸锂，50ml水及数滴溴水，开口继续沸腾15分钟，以驱除过量的溴，冷却后呈黄色(或微绿色，若呈绿色须重复滴加溴水的步骤)，稀释至1L，使最后浓度1mol/L酸度，过滤，滤液置于棕色瓶中备用五、实验主要仪器722分光光度计恒温水浴试管移液管六、实验操作流程标准曲线制作→蛋白浓度测定→酶活力分析七、实验操作关键步骤1、标准曲线的制作：取9支试管，按下表加入试剂：管号试剂123456789葡萄糖1g/L（ml）0.000.050.100.200.300.400.500.600.70蒸馏水(ml)2.01.951.901.801.701.601.501.401.303,5-二硝基水杨酸(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.0各管溶液混合均匀，沸水浴中加热5min。取出立即用冷水冷却至室温，再向每管加入7ml蒸馏水，摇匀，于520nm处测A值.A520A520平均值以还原糖(mg数)为横坐标，A520值为纵坐标制作标准曲线。各步酶活力的测定：按下表加样反应（单位：ml）编号样品空白1Ⅰ(1：50)Ⅱ(1：50)Ⅲ(1：50)Ⅳ(1：10)2345678910111213乙酸缓冲液0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4蔗糖5%0.40.40.40.40.40