实验十四土壤中微生物的分离与纯化

实验十四土壤中微生物的分离与纯化一、实验目的1、学习并掌握倒平板的方法，进一步掌握无菌操作技术；2、掌握常用的分离纯化微生物的方法；3、了解微生物常用的接种和培养方法，熟练掌握斜面接种的方法和技术。二、基本原理平板分离法操作简便，普遍用于微生物的分离和纯化，基本原理包括两个方面：1、选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化至得到纯菌株。2、微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可以通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察菌落特征之外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。三、实验器材1、材料土壤样品10g2、培养基（1）高示Ⅰ号培养基（加酚液培养放线菌）可溶性淀粉（20g），KNO3（1g），K2HPO4（0.5g），MgSO4·7H2O（0.5g），NaCl（0.5g），FeSO4·7H2O（0.01g），琼脂20g，pH=7.4-7.6。（2）牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，水1000ml，pH7.4-7.6。（3）查氏培养基（加链霉素液培养霉菌）硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。（制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min）3、溶液或试剂10%酚、链霉素、工业酒精4、仪器及其他用具盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、涂布器、1-2ml无菌吸管、0.1-0.2ml无菌吸管、接种环，酒精灯、无菌培养皿、试管架、培养箱、记号笔、废液缸、链霉素、显微镜、血细胞计数板等。四、实验方法及步骤1、微生物的分离方法（1）用稀释平板法从土壤中分离真菌。（使用查氏培养基）（2）用平板涂抹法分离土壤中的放线菌。（使用高氏一号培养基）（3）用平板划线法分离土壤中的细菌。（使用牛肉膏蛋白胨培养基）2、制备土壤稀释液（1）称取土壤10g，用研钵研碎放入90mL无菌水的三角瓶中（加入玻璃珠），振荡10min，即为稀释10－1的土壤悬液。（2）另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4。取已稀释成10－1的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－3、10－4土壤稀释液。3、稀释平板法（使用查氏培养基）（1）每组取培养皿2只，即每个同学做1只。先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。（2）另取一吸管，以无菌操作法吸取10－3或10－4土壤稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边，在皿的另一边加入2滴10％酚。此时两液严防相混。（3）取已熔化的在水浴锅中保温45－500C左右的查氏培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、10％酚、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于280C恒温培养。4、平板涂抹法（使用高氏一号培养基）（1）每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。（2）以无菌操作法先在培养皿中加入重铬酸钾溶液溶液2滴，取已熔化的高氏一号培养基，分别倒入培养皿，使培养基与重铬酸钾溶液充分混匀，铺平，制成平板。（3）凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释液0.2mL放在平板上。（4）用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于280C条件下培养。5、平板划线法（使用牛肉膏蛋白胨培养基）（1）每组取无菌培养皿2只，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。（2）凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－3或10－4）在平板上划线。连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。（3）划线完毕，盖上皿盖，倒置于370C温室培养。（图一）从土壤中分离微生物的操作过程五、实验结果的观察与记录1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌)24h和48h各观察一次，记录菌落形态、颜色、大小；2、查氏培养基（培养真菌）48h观察真菌菌落形态以及计数菌落。并计算出每g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得；3、高氏一号培养基（培养放线菌）100～120h观察菌落形态及计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量（方法同上）。4、四大类微生物菌落形态的比较和识别区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面的观察。菌落形态：菌落表面湿润：细菌——---薄而小，酵母菌——厚而大。菌落表面干燥：放线菌——-密而小，霉菌——----松而大。六、注意事项1.接种环要灼烧灭菌，灭菌后放入菌液或要接触菌体前要冷却，接种后要在火焰上将多余的菌种烧死。2.实验操作时菌体不应和火焰太过接近，防止烧死菌体和烧着棉塞。3.培养时要倒置培养，防止染菌。4.取单菌落时不要碰到其它的菌落。5.本实验要严格的按照无菌操作进行。七、思考题1、在平板划线法中，为什么每次都需将接种环上的剩余物烧掉？2、为什么要将培养皿倒置培养？3、怎样确定你所得到的单菌落是否是纯种。4、在分离放线菌的过程中为什么要加入10%的酚？专业：10农业资源与环境班姓名：徐斌学号：2010025143电话：[phone]