实验四动物血液中DNA的提取-教案

授课教师常祖明学生人数55课题血液基因组DNA的提取授课类型新授课授课方法讲授、演示教学用具多媒体、实验室设备教学目的掌握鸡血DNA提取的原理及方法教学重点理解实验过程中每一步操作的目的及原理教学难点教学过程一、实验目的1.掌握鸡血DNA提取的原理；2.掌握鸡血DNA提取的方法及操作过程。二、实验原理哺乳动物的成熟红细胞已经高度分化，因而当中没有细胞核，无法提取DNA。禽类的血细胞则可以。禽类代谢旺盛，血液中红细胞更多，而且红细胞中有完整的细胞核、大量的染色体。且材料易得、经济。用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。三、实验仪器1.水浴锅：55℃2.离心机：8000转、12000转3.离心管：5ml（120个）4.移液枪：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml5.容量瓶：100ml6.取血针及管四、实验材料及药品实验材料：普通家鸡：需血液4.08ml（每管136l）1.无水乙醇作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。理化性质：无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。2.柠檬酸作用：ACD抗凝血剂成分之一。在抗凝剂中，中和柠檬酸钠的碱性。商品信息：分析纯AR，白色塑料瓶/500g，理化性质：无臭，有很强的酸味，白色粉末或颗粒，易溶于水和醇。在潮湿的空气中微有潮解性。储存：在湿空气中有轻微潮解，需阴凉密封干燥保存。危害：柠檬酸浓溶液对黏膜有刺激作用。柠檬酸可燃。粉体与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧爆炸的危险。3.柠檬酸钠作用：ACD抗凝血剂成分之一。能与血液中的钙离子结合成螯合物，而使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固。商品信息：柠檬酸三钠分析纯500克/瓶。理化性质：有机化合物，外观为白色到无色晶体。无臭,有清凉咸辣味。常温及空气中稳定,在湿空气中微有溶解性,在热空气中产生风化现象。加热至150℃失去结晶水。易溶于水、可溶于甘油、难溶于醇类及其他有机溶剂，过热分解，在潮湿的环境中微有潮解，在热空气中微有风化，其溶液pH值约为8。储存：常温密闭保存危害：无毒4.尿素作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白质变性，尤其能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质。商品信息：化学试剂分析纯500克/瓶（塑料瓶装）理化性质：无色柱状结晶或白色结晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，难溶于乙醚，不溶于氯仿。储存：密封避光保存。危害：避免与皮肤和眼睛接触。5.十二烷基硫酸钠(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白质复合体，用于从蛋白质中分离核酸。商品信息：500g/分析纯AR。理化性质：白色或淡黄色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于热水，溶于水，溶于热乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。储存：密封阴凉干燥保存防止受潮受热危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。该品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。6.1MTris-HCl(PH8.0)缓冲液作用：禽血裂解液成分之一。提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。储存：室温保存。危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。7.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作用：配制0.5MEDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化组蛋白，释放出DNA；消化DNase，提高DNA产量商品信息：（20mg/mL）1ml/支。理化性质：一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌中纯化得到。储存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。危害：使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质。9.Tris饱和酚（共需60ml，每管2ml）作用：强蛋白质变性剂。商品信息：瓶/250ml。理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25%8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。储存：4℃避光保存。危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。商品信息：瓶/500ml。理化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。储存：保存在密封的棕色瓶中。危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。11.异戊醇作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。商品信息：瓶/500ml。理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。12.无水葡萄糖作用：ACD抗凝血剂成分之一。商品信息：500g/瓶。理化性质：无色结晶或白色结晶性粉末；无臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。储存：无水葡萄糖易吸水结块，因此应密封保存。危害：无。五、实验试剂1.75%的乙醇{75ml+25ml水}→100ml75%的乙醇2.ACD抗凝剂100ml（共需48ml，每管0.8ml）{柠檬酸0.48g+柠檬酸钠1.32g+葡萄糖1.47g}→加水至100ml，灭菌后备用。3.禽血裂解液100ml（共需51ml，每管1.7ml）{尿素12g+SDS1g+1MTris-HCl(PH8.0)10ml+0.5MEDTA(PH8.0)20ml}→加水定容至100ml，备用。【0.5MEDTA（PH8.0）】的配制：100ml{水80ml+EDTA-2Na18.61g}→用NaOH（约2g）调至PH8.0→定容至100ml→分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-异戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml{氯仿96ml+异戊醇4ml}=100ml，4℃保存5.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml{氯仿-异戊醇（24:1）40ml+Tris饱和酚40ml}=80ml，4℃保存6..TE缓冲液PH8.050ml{10mMTris-HCl（PH8.0）缓冲液0.5ml+0.5MEDTA（PH8.0）0.1ml}→→定容到50ml→高压灭菌后冷却4℃保存【0.5MEDTA（PH8.0）】的配制：100ml{水80ml+EDTA-2Na18.61g}→用NaOH（约2g）调至PH8.0→定容至100ml→分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。【10mMTris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml{1MTris-HClPH8.0缓冲液100μl+水9.9ml}→定容至10ml→10mMTris-HCl（PH8.0）缓冲液六、实验步骤1.采用翅静脉采血，抽取血液5mL，溶于20mL75%的乙醇中，振荡混匀，配成家鸡血样25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比无水乙醇效果好，血样不至于太干涩。酒精:血(4:1)混合的血样保存时间长，可达4个月。2.取血样(酒精:血＝4:1)680L至5mL离心管中，8000转离心1分钟，弃上清；目的：去除血样中大部分的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。3.加800LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；再加800LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；目的：ACD抗凝剂可以螯合血液中的钙离子，防治血细胞凝集成团凝固，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。多次离心可以去除血样中的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。4.加1700L裂解液，10L蛋白酶K（100g），摇匀，55℃水浴保温过夜；目的：DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来，蛋白酶k还可以消化DNAse，提高DNA产量。55℃水浴保温过夜可以让蛋白酶K充分发挥作用。5.加2mL饱和酚，摇匀至无块状物，12000转离心10分钟；目的：饱和酚是强蛋白质变性剂，可以将蛋白质及降解后的产物充分变性，变性后的蛋白质溶解度减低，易沉淀。6.吸取上层透明的DNA溶液至另一5mL离心管中，注意不要搅拌下层的酚－蛋白层；目的：加入饱和酚后溶液分层，上层是透明的DNA溶液，再往下是变性的蛋白质，饱和酚的比重最大在最下层。7.加2mL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），摇匀至悬浮液，12000转离心10分钟；目的：加入酚-氯仿-异戊醇进一步去除DNA溶液中的残留蛋白质。8.吸取上层DNA液于另一5mL离心管中，加1.8mL氯仿-异戊醇溶液，摇匀，12000转离心10分钟；目的：由于酚与水有部分混溶，DNA水溶液中会混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-异戊醇在抽提一次可以把酚带走。9.吸取上层DNA液900L于另一5mL离心管中，加无水乙醇至满，颠倒混合，试管中出现白色团块，即是DNA；目的：DNA水溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇与DNA不相溶但与水相溶，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用无水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA会部分溶于水中，降低DNA沉淀的产量。10.吸出试管中的无水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重复2次；目的：像前面步骤中加入的抗凝血剂中的柠檬酸钠、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，经乙醇沉淀后的DNA中会有以上杂质存在。以上杂质有个共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗涤，可以利用其中的15%的水溶解这些杂质除去。11.将DNA自然晾干后溶入1000LTE缓冲液，-20℃保存；目的：乙醇已挥发除去，TE缓冲液一可以抑制Dnase活性，二维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。七、实验注意事项1.在整