实验二细菌基因组DNA的提取

细菌基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取时间。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。3、核酸制备的一般方法和原理DNase抑制①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核小体上的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的蛋白质变性剂1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的酶DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸核酸提取的一般过程细胞破碎机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。DNA提取SDS（十二烷基硫酸钠）法：SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA纯化（去杂质）蛋白质：常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA：常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质：提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖：提取液中加1％PVP。核酸提取的一般过程核酸样品的保存温度：4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0二、材料、设备及试剂菌种：大肠杆菌设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器，水浴锅（37℃、60℃）试剂：LB液体培养基、RNA酶A、无水乙醇无菌水（或TE）缓冲液、10%的SDS、20mg/ml的蛋白酶K，、5mol/LNaCl、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、异丙醇、75%乙醇、CTAB/NaCl溶液(CTAB:5gCTAB溶于100ml0.5molNaCl中，加热到65度溶解。）1、培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.2ml的培养物离心12000rpm,1min。2、沉淀物加入570ul的无菌水（或TE）缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30ul10%的SDS和10ul20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。3、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀，于60℃温育10min。(上下颠倒混匀)，离心，12000rpm,5min。4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提两次）5、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟，离心,12000rpm,10min。6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗涤，离心5min，弃上清液，重悬于30ul的无菌水（或TE）缓冲液。三、操作步骤四、注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融四、注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：•植物材料－－液氮研磨•动物组织－－匀浆或液氮研磨•组培细胞－－蛋白酶K•细菌－－溶菌酶破壁•酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡四、注意事项——核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法四、注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解•TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase•pH值为8.0，可防止DNA发生酸解