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实验四动物细胞培养基的配置和原代培养一实验项目简介1、实验学时6学时2实验过程：A动物细胞培养液的配置B采用组织培养法培养鱼类细胞二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织(或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。鱼类细胞组培的一些方法：（1）组织块固定法当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块,按一定比例将组织块贴在瓶壁上,至少三十分钟以上,然后轻轻加人营养液置温箱培养。（2）机械分散法此法适用于细胞间连接较松散的组织,如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐的小块,放入底部有一铜网的注射器内,用手的压力将组织挤出网孔,最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。（3）络合剂分散法目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸,它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散,经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系的传代。（4）酶消化法该法是目前采用极为广泛的方法,适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶,常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同,又可进一步分为冷消化法及热消化法。（5）冷消化法此法是将组织剪成约刀的小块,然后置一倍体积的胰酶中,四摄氏度培养。三、实验目的1、掌握动物细胞培养缓冲液、消化液的配置。2掌握动物细胞原代培养的基本过程。四、实验试剂DMEM培养基胰蛋白酶Hanks缓冲液抗生素溶液牛血清70%乙醇去离子水五、实验用品器材：解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，六、实验步骤培养液的配置1、DMEM培养液的配置：将1袋袋装的干粉溶解于1L去离子水中，加3.7gNaHCO3,溶解，调节PH7.2,过滤除菌，4℃保存。2、双抗溶液的配置：将青霉素、链霉素溶解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为100U/mL。六、实验步骤3、D-Hanks缓冲溶液：称取8gNaCl，0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4,0.35gNaHCO3溶解于1000mL去离子水中，高压灭菌，4℃保存。六、实验步骤鱼类细胞的组织培养法1．取材：迅速处死动物，无菌分离肝脏,置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。六、实验步骤2.接种、培养：将肝脏剪成1mm×1mm×1mm的组织块,用D-Hanks液洗3次,去掉血细胞,37℃下用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块20～25块。加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在37℃条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基继续培养。六、实验步骤3．观察置于37℃培养的细胞．需逐日进行观察．主要观察：(1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。(2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。六、实验步骤待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养了。七、注意事项细胞培养要求无菌操作。无菌是细胞培养成功的首要条件。重视进人无菌室操作前必须将培养瓶外表消毒提防试剂瓶中的液体浸湿瓶盖,这往往是试验污染的重要因素之一。八鱼类细胞原代培养意义鱼类培养细胞作实验验对象，有着活体鱼无法比拟的优点：(I)成本低，细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与换气。(2)重复性好，实验条件可以精确控制。因此，对鱼类细胞系进行深入研究，无论在理论研究方面，还是在实际应用方面，都具有深远意义。八鱼类细胞原代培养意义在对细胞的营养需求有比较深人认识的基础上,化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠卵巢细胞汇和杂交瘤细胞的培养。虽然鱼类细胞培养中尚未成功应用无血清培养技术,但在这方面的研究已有一定基础,相信在不久的将来鱼细胞培养技术会有所突破,更广泛地应用于研究领域。