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实验室的标准操作规程（SOP）•水产品和畜、禽肉中氯霉素残留量检验方法气相色谱法-质谱检测法•1方法提要•根据方法进行验证修改后,并依据欧盟指令建立了质谱测定条件，将某些关键步骤进行细化。•本方法适用于水产品和畜、禽肉组织、肠衣中氯霉素残留确证检测。用乙酸乙酯提取，提取液用正己烷净化，硅烷化后用气相色谱配有负化学源的5973N质谱检测器检测。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•2实验室设备•2.1仪器和设备•2.1.1Agilent6890气相色谱仪：配有负化学源的5973N质谱检测器。•2.1.2离心机：5810型，Eppendorf公司。•2.1.3均质器：T25型，18G刀，IKA公司•2.1.4旋转蒸发器：R-200，BUCHI公司。•2.1.5移液枪：200μL、1000μL、5000μL，Eppendorf公司。•2.1.6具塞塑料离心管：15mL、50ML。•2.1.7涡流混匀器：39760型，Thermolyne公司。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•2.2试剂•所有试剂均为分析纯级（有机试剂需重蒸馏），水为去离子水。•2.2.1乙酸乙酯。•2.2.2甲醇。•2.2.3正己烷。•2.2.4氯化钠。•2.2.5无水硫酸钠：经650℃灼烧4h，置于干燥器内备用。•2.2.6硅烷化试剂：SylonBFT{99%N,O-双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）{美国Supelco产品，货号33154-u，0.1mL/ampul}。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•2.3标准物质•2.3.1氯霉素（chloramphenicol）：纯度≥99%，Amresco分装，上海生工生物工程有限公司和Sigma公司。•2.4标准溶液的配制•2.4.1标准储备液的配制•准确称取氯霉素标样50mg置50ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，混匀，浓度为1mg/mL，4℃保存6个月。•2.4.2标准工作溶液配制：•取1mL储备液用甲醇溶解定容到100Ml，此时浓度为1μg/mL，取1μg/mL1mL定容至10mL，浓度为0.1μg/mL；取1μg/mL0.5mL定容至10mL，浓度为0.05μg/mL。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•3实验方法•3.1试样制备•从所取原始样品中取出部分有代表性样品，经充分混匀。用四分法缩分出不少于500g试样，混匀，均分成两份。装入清洁容器内，加封后，表明标记。•3.2测定步骤•3.2.1提取与净化•称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中。加入25mL乙酸乙酯，用均质器均质提取2min，4000r/min离心3min。将乙酸乙酯层移入50mL鸡心瓶中，试样再加入5mL乙酸乙酯，涡流混匀器混匀1min，合并乙酸乙酯提取液，于40℃旋转蒸发至近干。•加入1mL甲醇溶解残渣，再加入20mL4%氯化钠溶液和15mL正己烷，用涡流混匀器混合1min，4000r/min离心3min。弃去正己烷层，水层加15mL正己烷，同上操作，弃去正己烷层。水层中加入15mL乙酸乙酯，用涡流混匀器混合2min，3000r/min离心3min。吸取乙酸乙酯层，通过无水硫酸钠柱（5g）脱水于另一个50mL鸡心瓶中，用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱。于40℃旋转蒸发至约1mL。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•3.2.2衍生化•将浓缩液移入5mL离心管中，用1mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯。于40℃吹氮气蒸发至干。加入100µL正己烷和100µL硅烷化试剂，于70℃烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50mL正己烷与环己烷混合液（6：4），混匀溶解，供气相色谱测定。•3.2.3测定•3.2.3.1气相色谱条件•a)色谱柱：30m×0.25mm×0.25µm，HP-5MS；••c)PTV进样口温度：70℃(1.0min)700℃/min250℃(6.0min)700℃/min300℃；•d)载气：氦气，恒压模式，柱头压10psi；•e)进样量：2uL实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•3.2.3.2质谱条件•a)传输线温度：280C•b)溶剂延迟：5min•c)离子源温度：150C•d)四极杆温度：100C•e)反应气：甲烷，流量：2ml/min•f)选择离子监测•目标物监测离子•氯霉素466，468，470，376•其中定量离子为466，定性离子为468，470，376•g)离子停留时间：60毫秒实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•3.2.3.3标准溶液的衍生化•取适量标准溶液，用氮气吹干，加入200µL正己烷和100µL硅烷化试剂，于80℃烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50mL正己烷与环己烷混合液（6:4），混匀溶解，供气相色谱-质谱测定。在上述色谱条件下：氯霉素保留时间为11.65min。•3.2.3.4样品测定•分别注射等体积的标准工作液、试剂空白、阴性控制样品、待检样品（不超过10个）、阴性控制和阳性控制样品，按上述色谱条件测定，峰面积定量。•4、气相色谱-质谱定性•(1)保留时间定性：在上述条件下,目标化合物的保留时间为11.65±0.1min实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•(2)质谱确证•在保留时间窗口内出现色谱峰后，获取其质谱图，扣除本底后如果以下判别标准全部符合，则可判定氯霉素存在：•所有4个监测离子全部在质谱图中出现•离子466为基峰和定量离子，其它3个离子与基峰丰度之比应符合如下标准•质荷比标准丰度比（%）允许相对偏离范围（%）•46876±20•47018±30•37620±25实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•5、质量控制•每组实验除标准、样品，需同时进行溶剂空白实验、阴性控制样品实验和阳性控制样品实验。•5.1溶剂空白•不加试样，用与样品相同的方法进行处理。•5.2阴性控制样品•称取5.0克阴性控制样品，置于50mL离心管中，用与样品相同的方法进行处理。•5.3阳性控制样品•称取5.0克阴性控制样品，置于50mL离心管中，用微量注射器加入0.1µg/mL的氯霉素标准工作液25µL，相当于样品浓度0.5ng/g用与样品相同的方法进行处理。用相同浓度的标准进行定量，计算回收率，用来判断本组操作的可靠性。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•6结果计算•6.1外标法定量•用色谱数据处理机或按下列公式计算：••式中：X——试样中氯霉素药物残留含量，mg/kg；•A——样液中硅烷化氯霉素色谱峰面积；•AS——标准工作溶液中硅烷化氯霉素色谱峰面积；•c——标准工作溶液中氯霉素的浓度，µg/mL；•V——最终样液的定容体积，mL；•m——最终样液所代表试样量，g。•计算结果需扣除空白值。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•7测定低限•本方法氯霉素的测定低限为0.2µg/kg.•8可接受的检验结果•在添加浓度0.5μg/kg时，回收率，50%~120%。•9检测报告•按照SPSBA00024检验报告管理程序执行。•10方法验证•10.1取相当于1μg/g的氯霉素衍生化物，在200-600M/z范围，进行全扫描分析，确定定量离了和确证离子及其丰度比，见附录1。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素•10.2标准工作曲线•用注射器分别移取0.05µg/mL，20µL、30µL、60µL；0.1µg/mL，50µL,1µg/mL,25µL、标准工作液置于6个5ML离心管中，氮气吹干，其系列分别相当于样品中0.2、0.3、0.4、1、5ng/g的浓度。•分别注射等体积的标准工作液按给定的色谱条件进行测定，用GC-NCI-MS测定。记录峰面积，以峰面积为纵坐标，目标化合物浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，计算线性关系，得到相关系数，结果见附录2。•10.3回收率实验和室内精密度实验•以阴性控制样品为测试样品，添加水平分别为0.2μg/kg，0.3μg/kg，0.4μg/kg，做6个平行样，共做三次，用对应工作曲线计算每个样品的浓度，并计算回收率、标准偏差和变异系数。•参考文献