实验方案gateway

实验方案Gateway®反应的基本原理BP反应—构建Gateway®入门克隆LR反应—构建Gateway®表达克隆一管模式—从PCR产物构建Gateway®表达克隆Gateway®载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gateway®载体TOPO®TA克隆-创建Gateway®入门克隆步骤一–制备PCR产物使用Taq聚合酶和自己的方案生成PCR产物。通过最后7到30分钟的延伸步骤，结束PCR反应。步骤二-进行TOPO®克隆反应1.按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO®克隆反应。对于电穿孔，将盐溶液稀释4倍以制备稀释盐溶液。试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR产物0.5至4µl0.5至4µl盐溶液1µl--稀释盐溶液--1µl无菌水至终体积为5µl至终体积为5µlTOPO®载体1µl1µl总体积6µl6µl2.轻轻混合并在室温下孵育5分钟。3.置于冰上，然后开始转化OneShot®化学感受态E.coli，步骤如下步骤三-转化OneShot®化学感受态E.coli1.每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶OneShot®E.coli细胞。2.在一小瓶OneShot®化学感受态E.coli中加入2µlTOPO®克隆反应液，轻轻混匀。3.在冰上孵育5至30分钟。4.将细胞置于42°C下热休克30秒，不振荡。立即将试管转移至冰上。5.加入250µl室温S.O.C.培养基。6.在37°C下振荡孵育1小时。7.在预热的LB琼脂平板上涂布10-50µl细菌培养物（琼脂平板含有100µg/ml大观霉素），并于37°C下过夜孵育。Gateway®反应的基础知识BP反应从含有attB侧翼序列的PCR产物到生成Gateway®入门克隆只需1小时的简单反应。参见下文的实验设置概述。更多详细信息，请参阅说明书。1.在室温下向1.5ml管中加入下述组分并混匀：attB-PCR产物（=10ng/µl；最终量~15-150ng）1-7µl供体载体(150ng/µl)1µlTE缓冲液，pH8.0补充至8µl2.将BPClonase™II酶混合物置于冰上约2分钟解冻。对BPClonase™II酶混合物稍微震荡两次（每次2秒）。3.对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入2µlBPClonase™II酶混合物，稍微震荡两次以充分混匀。进行短暂的低速离心。4.将BPClonase™II酶混合物放回-20°C或-80°C储存。5.反应体系25°C孵育1小时。6.向每份样品中加入1µl蛋白酶K溶液来终止反应。稍微震荡。在37°C下孵育样品10分钟。转化7.取1µl的各LR反应液转化50µlOneShot®OmniMAX™2T1噬菌体抗性细胞（目录号C8540-03).冰上孵育30分钟。通过30秒的42°C孵育对细胞进行热休克。加入250µlS.O.C.培养基并在37°C震荡孵育1小时。将20µl和100µl每种转化液分别涂布于选择性平板上。注意：任何转化率达1.0×108转化子/µg的感受态细胞均可以使用。8.取1µlpUC19DNA(10ng/ml)转化50µl上述OneShot®OmniMAX™2T1噬菌体抗性细胞。在含100µg/ml卡那霉素或含供体载体的相应选择性标记物的LB平板上涂布20µl和100µl。预期结果如果转化并涂布全部BP反应液，则高效的BP重组反应将产生1500个以上的菌落。LR反应将基因从Gateway®入门克隆转移至目的载体只需1小时的简单反应。参见下文的实验设置概述。更多详细信息，请参阅说明书。1.在室温下向1.5ml管中加入下述组分并混匀：入门克隆(50-150ng)1-7µl目的载体(150ng/µl)1µlTE缓冲液，pH8.0补充至8µl2.将LRClonase™II酶混合物置于冰上约2分钟解冻。对LRClonase™II酶混合物进行两次短暂的漩涡震荡（每次2秒）。3.对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入2µlLRClonase™II酶混合物，并通过两次短暂的漩涡震荡将其混合均匀。进行短暂的低速离心。4.将LRClonase™II酶混合物放回至-20°C或-80°C储存。5.反应体系25°C孵育1小时。6.向每份样品中加入1µl蛋白酶K溶液来终止反应。稍微震荡。在37°C下孵育样品10分钟。转化按照BP的对应方案操作，不同的是需要在适合目的载体的LB平板上使用选择性标志物（通常是100µg/ml氨苄青霉素）。预期结果如果转化并涂布全部LR反应液，则高效的LR重组反应将产生5000以上个菌落。单管形式如果希望将两侧具有attB位点的PCR产物直接转移到表达克隆中，可以使用以下方案轻松的将BP和LR反应结合在一起。这样就避免了构建Gateway®入门克隆时的转化和DNA提取过程。1.在一个1.5ml的微型离心管中，准备如下的15µlBP反应体系：attBDNA(50-100ng)1.0-5.0µlattPDNA（pDONR™载体，150ng/µl）1.3µlBPClonase™II酶混合物3.0µlTE缓冲液，pH8.0，最终体积为15µl2.在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C孵育4小时。注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达20小时。与仅孵育1小时相比，过夜孵育通常可多产生5倍的菌落。对于较大的质粒(=10kb)和较长的PCR产物(=5kb)，推荐采用较长的孵育时间。3.从反应体系中取出5µl移到另一管中，用以评估BP反应的效率（见下文）。4.向余下的10µl反应体系中加入：目标载体(150ng/µl)2.0µlLRClonase™II酶混合物3.0µl最终体积为15µl5.在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C孵育2小时。注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达18小时。6.加入2µl蛋白酶K溶液。于37°C孵育10分钟。7.用1µl反应产物转化50µl相应的感受态E.coli。8.然后涂板于含相应抗生素的LB平板，以便筛选表达克隆。评估BP反应的效率1.向由上述“单管”方案的步骤3得到的5µl反应产物中加入0.5µl蛋白酶K溶液。于37°C孵育10分钟。2.用1µl反应产物转化50µl相应的感受态E.coli。涂板于含相应抗生素的LB平板，以便筛选入门克隆。Gateway®载体转化(Gateway®VectorConversion)将最爱使用的克隆载体组转化为Gateway®载体是一种相当直观的方案，这种转化最终能简化克隆和表达过程。如要将克隆载体转化为Gateway®目的载体，需要：1.根据需要选择合适的阅读框盒。2.利用选择的限制性内切酶，使要转化的载体线性化。0如果使用的限制性内切酶会产生突出末端，则需要把末端补平。3.使用小牛肠碱性磷酸酶去除载体中的5'磷酸。4.使用T4DNA连接酶将阅读框盒连接入载体中。5.用连接反应物转化OneShot®ccdBSurvival™感受态E.coli，并筛选转化子。6.分析转化子。Gateway技术──基因克隆和表达的新技术作者：文/Invitrogen公司时间：2004-06-0811:15:00来源:浏览次数1789次浏览评论Gateway技术具有以下优点：·去除冗长的亚克隆步骤,节省操作时间；·能同时将基因转移到多个表达系统；·在选择的任何系统──体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物──进行分析表达。Gateway技术是一项基因克隆和表达的新技术，通过Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项体外技术大大简化了基因克隆和亚克隆的步骤，克隆效率却高于95%。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，可以保证正确的方向和阅读框。此外Gateway技术也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。Gateway技术利用了位点特异性重组，所以在构建好入门克隆(entryclone)后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦拥有了一个入门克隆，就可以多次使用，转移目的基因到Gateway兼容的各种表达载体（destinationvector）。由于重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不必再对新的表达克隆进行测序。这样，在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多时间。目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。Gateway技术基于已深入研究的λ噬菌体位点特异重组系统（attBxattP→attLxattR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attBDNA片段或表达克隆和一个attP供体载体(Donorvector)之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。Gateway技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是＞95％。ccdB基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代。携带有ccdB基因的未反应载体或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长。完成构建Gateway表达克隆仅需两步（图2）：1创建入门克隆，通过PCR或者传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。2混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及GatewayLRClonase酶，构建表达克隆（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析）。在BP反应中，基因转移形成入门克隆；在LR反应中，入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。一旦构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会敞开。使用Gateway技术，可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析目的蛋白。为了扩展表达的选择，Invitrogen公司已将Gateway技术整合到几乎所有的表达系统中。无论选择哪个系统──体外、细菌、酵母、昆虫或哺乳动物──都可以获得Gateway目的载体。此外，还可以很容易的把你自己最喜欢的表达载体转换成Gateway目的载体以及通过重组同时克隆多个片段。■