样品预处理新方案-----QuEChERS

样品预处理新方案-----QuEChERS主讲人：上海月旭公司食品安全检测产品经理样品前处理应用专家安保超（仪器信息网id:abc_1982）导言：食品安全问题是当今世界的重大问题，而农药残留是影响食品安全的重要因素之一。在全球范围内，每年大约有超过2000种食品样品用作农药残留分析，因此，发展快速、可靠、灵敏和实用的农药残留分析技术无疑是控制农药残留、保证食用者安全和避免贸易争端的基础。农药残留分析是一项复杂的痕量分析技术，而传统的提取净化技术，已远远满足不了现代农药残留分析的要求。随之而产生的更快速，更高效的前处理技术，就是本文要向大家介绍的QuEChERS方法。希望大家借此次交流机会，共同参与探索有关QuChERS的任何问题，欢迎大家就QuChERS的原理、工作步骤、以及产品组分、应用等问题前来提问，也欢迎农残检测方面的高手前来与abc_1982交流切磋。内容提纲：1.什么是QuEChERS?2.QuEChERS如何工作？3.QuEChERS产品选择指南4.如何克服基质效应5.QuEChERS应用扩展6.Welchrom®QuEChERS方法应用实例一、什么是QuEChERS?1.1引言：QuEChERS（发音类似于Catchers），取快速（Quick），简单（Easy），价廉（Cheap），高效（Effective），耐用（Rugged）和安全（Safe）六个单词的首字母。它是一种用于高湿度食品中多农药残留分析的样品制备与净化技术。自从Anastassiades和Lehotay等人在2003年创建这一技术以来，QuEChERS在食品中的农药分析领域里已引起了人们的广泛关注。它之所以可以用于食品的分析，是因为它将几步实验步骤合为一步，并与以往的费时费力的提取方法如Luke法相比，更拓宽了所能应用的极性农药的范围。该方法自出现以来在这几年里经历了许多改进。这些改进可以提高某些种类农药的回收率。在QuEChERS出现之前Schenck和Vega已于2001年发表了一个净化的方法，而该方法现已被整合到QuEChERS中以提高这种方法的可利用性。尽管QuEChERS主要用于水果和蔬菜的分析，它也可以作为许多食品样品，如蜂蜜，坚果，肉，大豆，动物食物，植物，以及其它食品等的制备方法。由于有机酸、植物色素和其它潜在的污染物在净化过程中将被除去，因此可以获得干净的色谱图谱。该方法的优点具有高的回收率，准确的测定结果，高的样品通量，以及低的无氯溶剂使用率。这可以减少试剂的成本，以及实验人员接触有害溶剂的可能性。另外，玻璃仪器的使用和劳动成本也会降低，这是因为所需要的样品量较小，因此无需太大的实验平台空间。宽的应用范围以及操作的简易性使得该方法成为残留物分析的首选方法之一。1.2QuEChERS方法原理：均质后的样品经乙腈（或酸化乙腈）提取后，采用萃取盐盐析分层后，利用基质分散萃取机理，采用PSA或其它吸附剂与基质中绝大部分干扰物（有机酸、脂肪酸、碳水化合物等）结合，通过离心方式去除，从而达到净化的目的。1.3QuEChERS发展历程二、Welchrom®QuEChERS如何工作2.1样品粉碎2.2萃取2.3d-SPE净化2.3QuEChERS产品中各成分的作用2.4为什么选择无水硫酸镁作为除水剂2.5d-SPE中为什么采用PSA作为净化吸附剂由于酸性农药（如2,4-D、灭草松等）会和氨基型吸附剂（如NH2、PSA）等发生结合而导致回收率降低，因此，对于分析含有这类目标化合物时，最好的分析方法是跳过d-SPE直接进LC-MS/MS进行ESI-分析。可采用Nicarbazin（尼卡巴嗪）作为内标。2.5d-SPE引入GCB（石墨化碳黑）的作用2.5.1色素存在对结果的影响GCB是将炭黑在惰性气氛下加热到2700℃-3000℃而制成。石墨化碳黑表面是由六个碳原子构成的平面六角形。多用于农残样品中色素的去除。起初活性炭被广泛用于色素的去除，但是活性炭由于吸附性太强（不可逆吸附），导致很多农药回收率偏低。近年来，活性炭已经使用的很少，慢慢的被石墨化碳黑所取代。由于石墨化碳对于片状化合物的特殊选择性，使用石墨化碳黑时可能也导致片状农药（百菌清、克菌丹等）的回收率降低，可以考虑通过在萃取液中加入甲苯来提高该类农药的回收率（乙腈甲苯比率一般为3：1）。小提示：Anthracene（蒽）与石墨化碳黑之间会形成非常强的吸附，可用来验证石墨化碳黑对平面农药的吸附程度，如果蒽的回收率在70%以上，说明平面型农药没有明显损失。同时，可以通过萃取液的颜色来判定石墨化碳黑是否造成平面型农药的损失。经验显示，如果萃取液呈淡黄色时，即说明平面型农药的损失不明显。2.5d-SPE引入C18E的作用一些样品中（如鳄梨、花生、橄榄油等）含有较多的脂肪，由于脂肪在乙腈中的溶解度有限，所以会导致部分脂溶性好的农药（如HCB、DDT等）的回收降低。如何克服脂肪造成的实验结果偏低，可以通过下面两个步骤去除样品中的脂肪。2.5.1冷冻除脂：将萃取液或净化后样品放入冰箱冷冻1h以上（或冷冻过夜）。2.5.2反相吸附剂吸附去除：在萃取液中加入C18E或C8吸附剂，吸附去除脂肪。小提示：如果目标分析物中含有非极性非常强的农药（如HCB、DDT等）农药时，脂肪的存在会导致内标TPP和这类农药的提取效率上的差异，这类农药由于损失的更多而导致结果偏低。对于这种现象，可以通过将内标延迟到分析前内标的方式来避免；同时，可以加入质控内标（PCB138或PCB153，Kow分别为6.83和7.75）验证整个处理过程中这类农药的损失，如果质控内标回收率在70%以上的，则说明该类农药无明显损失。2.7为什么选用乙腈作为萃取溶剂2.7.1常用提取溶剂优缺点2.7.2提取液的干净程度2.7〃3回收率参数在回收率方面，对于非极性农药来说，乙腈与乙酸乙酯没有明显的区别，但是乙腈可以提供更稳定的结果（RSD更小）；对于极性农药（拒嗪酮、甲胺磷、乙酰甲胺磷等）来说，乙腈的提取效率要高很多。三、Welchrom®QuEChERS产品选择指南3.1萃取盐析包选择指南3.1.1Welchrom®QuEChERS萃取盐析包产品目录3.1.2不同萃取盐析方法比较结论：实验数据显示，采用经典QuEChERS方法时，对于酸或碱敏感的农药的萃取效率通常很低，当样品的基质环境在pH值（5-5.5），这类农药可以获得一个更稳定的结果。因此，在AOAC和EN方法中，分别采用了乙酸钠和柠檬酸缓冲盐体系来保证样品基质环境的pH值（5-5.5），这样既可以保证碱不稳定的农药（如克菌丹、灭菌丹和对甲抑菌灵等）的回收，也可以保证酸不稳定的农药（如拒嗪酮、二氧威等）的回收。对于一些基质非常酸的样品（pH3），即使采用缓冲体系萃取盐时，整个样品的pH仍然低于5，这时可以加入5N的NaOH溶液来改善萃取效果。柠檬、黑加仑等样品，加入600μL的5NNaOH溶液木莓、山莓等，加入200μL的5NNaOH溶液结论2相比较于缓冲体系，非缓冲体系可以提供一个更干净的萃取液；采用非缓冲体系会导致百菌清等碱性敏感的农药没有一个稳定的回收；3.2d-SPE净化管选择指南3.2.1d-SPE净化管产品目录3.2.2根据样品类型推荐使用的d-SPE净化产品四、如何克服质谱引起的基质效应众所周知，质谱（特别是ESI电离源）受样品基质干净程度的影响很大；在实际分析过程中，经常出现稀释后的样品的响应却高于原样品。样品太脏，干扰物会严重的抑制目标化合物的电离，尽管采用内标法定量，但是由于内标采用的不是氘代内标，内标和目标化合物收到基质影响的程度不完全一致，这种情况势必会导致结果失真。如何克服基质效应带来带来的影响，本章将重点介绍:如何制作基质加标曲线？五、QuEChERS方法应用的扩展虽然QuEChERS刚开始时是针对水果、蔬菜中多农残提取的一个方法，但是现在它已经在越来越多的基质（谷物、香料）得到应用，同时，它已被采用在越来越多领域（比如，兽药vetdrugs，多环芳烃PAHs与抗生素）检测越来越多的不同样品（比如血浆、肉、土壤）。六、Welchrom®QuEChERS应用实例Welchrom®QuEChERS方法检测苹果中多农药残留三仪器条件四结果1、主要是在食品中的应用吗？答：是的，目前该方法还主要应用在食品领域。QuEChERS刚开始时是针对水果、蔬菜中多农残提取的一个方法，但是现在它已被采用在越来越多领域（比如，兽药，多环芳烃与抗生素等）检测越来越多的不同样品（比如血浆、肉、土壤）。但是相比较与农产品中的农药检测方法来说，后面的方法还没有经过广泛的数据验证。2、基质加标曲线能看出什么？答：严格说应该是标准加入法，主要是消除基质效应引起的结果失真，质谱检测器受基质的影响很大（目标化合物的电离非常容易收到基质的干扰而导致离子抑制），在实际的检测中经常会发现稀释后的样品响应值倒比原初样品高，这就是基质效应，不同农药收不同基质的影响也是不一样的，标准加入法主要是利用曲线中基质成分一致，默认目标化合物的响应受基质的影响一样，从而扣去基质效应的影响。目前也是很多机构在准确定量时公认的一种方法。3、那这个做法与做回收率有什么区别，它表现的不是回收率的结果吗？答：这个和回收率没有关系的，因为如果不考虑基质效应的话，我们通常是直接采用纯的标准曲线来定量，但是由于受基质效应的影响，同样浓度的标品在样品基质中纯的溶剂中的响应差别会很大，标准加入法就是去除这种差别的。4、在实际的检测中经常会发现稀释后的样品响应值倒比原初样品高，这能理解成基质的影响会造成含量偏低吗？答：5、这个QueChers产品应该多年前就已经在国外流行了，国内这块展开的工作比较少，不知道安经理能不能给我们大概对比一下用常规SPE和用Quechers产品，每个样品用的成本列一下，毛估估就行了。答：关于这两个方法成本比较很难，受具体的检测项目、样品是否需要浓缩、您是否使用QuEChERS成品等因素影响。有一个统计数据应该能说明这一个问题，在欧洲2009年的130～150个参加的实验室中有接近有40％是使用QuEChERS方法的检测农药残留。对于私人实验室，由于他们更加考虑成本，QuEChERS的采用率会高至接近70％。QuEChERS方法带来的样品高通量和有机溶剂的节省也是该方法在国外实验室广泛受关注的原因。Lethony曾在欧洲做过一个统计，传统的净化方法一个样品大约需要500mL的有机溶剂（Luke方法），而QuEChERS方法只需要10mL或15mL。6、看起来比SPE简单快捷呀，不知道是不是以后的趋势？答：这个应该是以后的趋势，该方法目前在国外应用已经非常广泛，国外好的东西传到国内到客户接受是需要一个过程，这个过程估计快过去了。而且目前国内很多大的单位或第三方检测都在采用这个方法，毕竟它的高样品通量对于这些单位是非常具有诱惑力的。7、这个样品前处理过程要大概花费多少时间？不同的食品样品差别大吗？答：QuEChERS方法对于6个预称重的样品，可以在30min内完成。不同的样品之间会有点区别，对于含水量大的样品，这个时间会更短，大约20min；对于干性样品（如面粉、茶叶、谷物等），由于需要加水浸泡样品，时间会适当的延长一些。8、讲座中提到基质效应的消除，但具体是怎样消除掉的呢？答：通过标准加入法，一个曲线有5个点，您可以取5个容量瓶，分别加入一定量的样品容量（保证5个试管中样品液的量是相同，对于浓度高的样品，可以进行稀释后操作），第一个不加标准品溶液，第二个和第五个分别加入不同体积的标准品溶液，最后用样品溶剂定容，分析。这样就可以得到一条曲线，这条曲线与X轴的截距就是该样品中目标化合物的试剂浓度。9、在国内还比较少听说，请问国内有哪些单位在用这个方法？哪些单位比较有可能在未来先开始使用？还有，在国内推广这个技术可能会遇到哪些困难？答：10、中华人民共和国农业行业标准NY/T1380-2007，我们实验室有使用过这个方法检测农残，方法与QuEChERS大致相同，但是实际中样品处理出现了很多问题，回收