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研究报告DOI:10．13995/j．cnki．11－1802/ts．201508002基于Staphylococcuscarnosus来源的D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶在大肠杆菌合成稀有酮糖的研究*李子杰，贺贝贝，高晓冬(江南大学生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)摘要将Staphylococcuscarnosus来源的FruAS.car醛缩酶基因fda和大肠杆菌来源的YqaB磷酸酶基因yqaB分别插入到表达质粒CDFDuet-1得到重组质粒CDF-fda-yqaB，并转化该重组质粒到大肠杆菌BL21Star(DE3)。以同时过量表达FruAS.car醛缩酶和YqaB磷酸酶的大肠杆菌BL21Star(DE3)/CDFDuet-1-fda-yqaB作为发酵菌株，以葡萄糖为碳源通过糖酵解途径在胞内生成供体磷酸二羟基丙酮，分别在培养基中添加丙醛、丁醛为受体，进行相应稀有酮糖的合成，从而成功地将羟醛缩合反应在大肠杆菌中实现，酮糖产物用HPLC检测并进行纯化和1HNMＲ鉴定。最后，以13C同位素全标记的葡萄糖为碳源，添加丙醛为受体进行了同位素标记实验，证实了产物从DHAP而来的3个碳原子最终来自葡萄糖。关键词醛缩酶;磷酸酶;稀有酮糖;大肠杆菌醛缩酶介导的羟醛缩合反应是合成手性C-C键［1－3］，的最重要方法之一。对于醛缩酶来说磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶研究最为广泛。该类醛缩酶催化DHAP供体分子与醛受体分子的羟醛缩合反应，醛缩酶能够决定产物中两个新生成的立体中心的构型［4］，并且不受底物的结构或立体化学的影响［5］。D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(FruA)活性高、能够以多种醛作为受体，是应用最为广泛的DHAP依赖型醛缩酶。FruA对DHAP分子的专一性要求非常高［6］，由于DHAP成本昂贵并且稳定性较差，不利于产物的大量制备［6－8］。在前期工作中，基于“一釜四酶法”的策略，以外消旋的DL-3-磷酸甘油作为起始底物在磷酸甘油氧化酶的作用下生成DHAP，同时与FruAS.car醛缩酶(Staphylococcuscarnosus来源)催化的羟醛缩合反应，［9］偶联制备了多种酮糖。虽然能够避免直接使用DHAP，在一定程度上节约了成本，但没能从根本上实现DHAP的大量合成问题。在本研究中，以便宜的底物葡萄糖作为碳源，通过糖酵解途径在同时表达FruAS.car醛缩酶和YqaB磷酸酶大肠杆菌工程菌胞内产生DHAP，并分别在培养基中添加醛受体丙醛、丁第一作者:博士，副教授(高晓冬教授为通讯作者，E-mail:xdgao@jiangnan．edu．cn)。*国家自然科学基金(21302069);中国博士后科学基金(2014M551500)收稿日期:2015－03－31，改回日期:2015－05－12醛合成相应的稀有酮糖。1材料与方法1.1质粒和菌株CDFDuet-1质粒和大肠杆菌BL21Star(DE3)，Novagen公司;pKK-fda质粒由Fessner教授提供;大肠杆菌MG1655和DH5α本实验室保存;用于基因扩增的引物在上海生工合成(表1)。表1本研究所用引物Table1Primersusedinthisstudy引物序列CDF-fda-F5＇-GCGCGGATCCGAACCAAGAACAATT-3＇(BamHI)CDF-fda-Ｒ5＇-GCGCCTGCAGTTAAGCTTTGTTTACTGAA-3＇(PstI)CDF-yqaB-F5＇-GCGCCATATGTACGAGCGTTATGCAGGTT-3＇(NdeI)CDF-yqaB-Ｒ5＇-TATACTCGAGCAGCAAGCGAACATCCACG-3＇(XhoI)1.2酶、试剂和培养基DNA聚合酶从Invitrogen公司购买;限制性内切酶和T4连接酶购于宝生物公司;链霉素、M9无机盐、盐酸硫胺素购自Sigma-Aldrich;硅胶购自EMDChemicals公司。LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，121℃湿热灭菌20min;M9培养基(g/L):Na2HPO46，KH2PO43，NaCl0.5，NH4Cl1，MgSO40.12，CaCl20.0111，硫胺素0.001，ZnSO40.0032。1.3CDF-fda-yqaB重组质粒的构建以质粒pKKfda为模板，使用CDF-fda-F和CDF-2015年第41卷第8期(总第332期)7食品与发酵工业FOODANDFEＲMENTATIONINDUSTＲIESfda-Ｒ分别作为上下游引物通过PCＲ扩增基因fda;以大肠杆菌MG1655为模板，以CDF-yqaB-F和CDF-yqaB-Ｒ分别作为上下游引物扩增基因yqaB;使用限制性内切酶BamHI，PstI分别对fda基因片段和CDF-Duet-1质粒进行双酶切、连接、转化DH5α，筛选阳性转化子，得到重组质粒CDF-fda;使用限制性内切酶NdeI，XhoI分别对yqaB片段以及质粒CDF-fda进行双酶切，连接、转化、筛选阳性转化子，得到重组质粒CDF-fda-yqaB。1.4稀有酮糖的制备表达质粒CDF-fda-yqaB转化BL21Star(DE3)感受态细胞得到BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB重组菌株。将LB培养基中过夜培养的该重组菌株的培养液以1∶50的比例转接到以5g/L葡萄糖为碳源、链霉素终浓度为100μg/mL的M9培养基中(2L)，在37℃，225r/min条件下培养。当测得菌液OD600为0.8～1.0时，调整温度为30℃后，加入过滤灭菌终浓度为1mmol/L的IPTG。IPTG诱导蛋白表达2－3h后，加入终浓度为30mmol/L丙醛(过滤除菌)。在发酵过程中，当葡萄糖或丙醛的量不足时，适当补加，并用NaOH溶液来调节发酵液的pH，使其维持在7.0左右。当在培养基中添加丁醛作为醛受体(加入丁醛的终浓度为40mmol/L)，发酵流程参考丙醛为醛受体的发酵。当产物的量没有显著增加时，结束发酵，整个发酵过程约为40h。1.5稀有酮糖的分离和纯化发酵结束后对发酵液进行离心(4000g，20min，4℃)，将上清液转移到烧瓶中进行减压浓缩。浓缩产物用硅胶纯化，流动相为二氯甲烷∶甲醇为20∶1(v/v)，流出液按照先后顺序进行依次收集，首先初步判定目的产物位于哪些离心管中，然后以二氯甲烷∶甲醇20∶1(v/v)为展开剂并以体外合成的相应酮糖产物作为对照，通过TLC检测来确定含有目的产物的洗脱液。收集目标洗脱液，浓缩、干燥、称重，用1H-NMＲ检测纯度。1.6同位素标记实验将过夜培养的大肠杆菌菌液以1/50的比例转接到以5g/L13C全标记葡萄糖作为碳源，链霉素终浓度为100μg/mL的M9培养基中(100mL)。整个发酵过程参照1.4。当葡萄糖利用完全且产物的量没有显著变化时终止发酵。产物的分离纯化参照1.5，并用13CNMＲ检测。1.7分析方法HPLC检测条件如下:色谱柱型号为Bio-ＲadHPX-87H(300mm×7.8mm，氢型阳离子交换柱)，流动相为5mmol/LH2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为60℃，示差检测器检测。2结果和讨论2.1构建重组表达质粒CDF-fda-yqaB首先验证重组质粒CDF-fda是否构建成功，通过BamHI，PstI双酶切能够检测到fda基因(888bp)大小的片段(图1-a)，表明fda基因片段已经插入到CDFDuet-1质粒中并对fda基因进行测序。为了验证表达质粒CDF-fda-yqaB是否构建成功，经过BamHI，XhoI双酶切能够检测到大约1600bp大小的片段(图1-b)，根据基因fda和yqaB的大小，可以推断yqaB基因已经成功插入到质粒CDF-fda并进一步对yqaB基因进行测序。1－DNAmarker;2－CDF-fda质粒BamHI，PstI双酶切;3－DNAmarker;4－CDF-fda-yqaB质粒BamHI，XhoI双酶切图1重组质粒CDF-fda-yqaB的构建Fig.1ConstructionoftherecombinantplasmidCDF-fda-yqaB2.2醛缩酶FruAS.car和磷酸酶YqaB在大肠杆菌中的表达使用重组表达质粒CDF-fda-yqaB在大肠杆菌BL21Star(DE3)同时过量表达醛缩酶FruAS.car和磷酸酶YqaB。理论上，FruAS.car和YqaB蛋白的分子质量分别为32.855kDa和20.78kDa。从SDS-PAGE图来看(图2)，这两种蛋白的大小基本上与理论值一致，从而说明醛缩酶FruAS.car和磷酸酶YqaB成功得到了表达。2.3以丙醛(丁醛)为醛受体发酵制备稀有酮糖在前期体外实验中，利用醛缩酶FruAS.car分别以丙醛、丁醛等受体合成了D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖、D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖等稀有酮糖［9］。在体外实验中，酸性磷酸酶(AP)常用来脱磷酸化得到相应酮糖［9］，由于AP的最适pH偏酸性，不适合在82015Vol.41No.8(Total332)1－蛋白Marker;2－未诱导全细胞;3－诱导10h后全细胞图2SDS-PAGE检测FruAS.car和YqaB的表达Fig.2SDS-PAGEanalysisoftheexpressionofFruAS.carandYqaB大肠杆菌细胞内的脱磷酸化。通过查阅文献发现来源于大肠杆菌的磷酸酶YqaB在中性pH(生理条件下)具有较强的磷酸酶活性［10］。首先在体外实验中研究YqaB磷酸酶对底物D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖-1-磷酸和D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖1-磷酸的脱磷酸化作用，通过TLC检测发现该磷酸酶可以脱掉相应酮糖-1-磷酸的磷酸基团得到相应的酮糖(未显示结果)。为了在大肠杆菌合成如上两种稀有酮糖，以BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB作为发酵菌株，以廉价的葡萄糖作为碳源，分别在培养基中添加丙醛、丁醛作为醛受体，进行相应酮糖的合成。为了检测是否有目标酮糖产物的生成，对发酵液上清进行HPLC检测，并分别以体外合成纯化的两种稀有酮糖作为对照。由图3可以看到，D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖能够被检测到(如箭头所示);由图4可以看到，D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖能够被检测到(如箭头所示)。从而说明分别以丙醛、丁醛为受体，能够分别在大肠杆菌中合成相应的稀有酮糖。当在培养基中添加丙醛作为醛受体，对于2L的发酵，发酵上清液经过硅胶纯化，能够制备D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖(300mg);当在培养基中添加丁醛作为醛受体(2L)，发酵液经过纯化，能够制备D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖(321mg)。纯化后的酮糖产物用1HNMＲ进行确认，如图5所示。总体上来说，以丙醛、丁醛为醛受体的发酵，分离纯化后得到相应稀有酮糖的产量比较低，分析其可能的原因如下:由FruAS.car醛缩酶体外合成实验可以推断，和D-甘油醛相比，FruAS.car醛缩酶对丙醛、丁醛的活性比较低;YqaB磷酸酶对D-果糖-1-磷酸具有较高的磷酸酶研究报告图3HPLC检测在大肠杆菌中合成D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖Fig.3HPLCanalysisoftheproductionof5，6-dideoxy-D-threo-2-hexuloseinE.coli图4HPLC检测在大肠杆菌中合成D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖Fig.4HPLCanalysisoftheproductionof5，6，7-trideoxy-D-threo-heptulose活性，而对D-苏式-5，6-二脱氧-2-己酮糖-1-磷酸和D-苏式-5，6，7-三脱氧-2-庚酮糖-1-磷酸脱磷酸基团的活性比较低;丙醛、丁醛对大肠杆菌菌体生长具有抑制作用。为了提高产量，一方面对调节DHAP合成的上游基因过量表达，同时敲除DHAP的代谢支路在胞内积累DH