基于TALE的基因操作研究进展

1基于TALE的基因操作研究进展（上海交通大学农业与生物学院，上海200240）摘要：TALE(Transcriptionactivation-likeeffector)是黄单胞菌(Xanthomonas)与寄主植物互作所分泌到植物细胞中的一种效应蛋白T3SE(TypeⅢsecretioneffector)。它可以特定的结合到靶基因启动子的某些元件而激活靶基因的转录。TALE存在串联重复的结构，这种重复结构与其结合靶序列间存在着一定对应关系：重复片段中的12,13位氨基酸决定了结合靶序列的碱基特异性。基于此所构建出的人造TALE(dTALE),再结合内切酶以及抑制子等其他部件就可以对基因组进行修饰和对基因的表达进行调控。该技术有助于我们更好的人为定向地改造生物，也为人类疾病预防和治疗提供了新思路。关键词：TALE：修饰；调控；基因组；基因表达；生物技术Abstract:TALE,akindoftypeⅢeffector,canbesecretedintoplantcellsbyXanthomonasduringtheinteractionbetweenpathogensandplants.Itcanspecificitybindthesequenceonthepromoterofthetargetgenestoactivatethetranscriptionofthetargetgene.ThestructureofTALEcontainstandemrepeat.ThereisacertainrelationshipbetweentherepetitivestructureandthetargetsequenceTALEbind:theaminoacidsat12and13positionassociatespreferentiallywithoneormoreofthefournucleotides.UsingthisrelationshiptobuildartificialTALEcombinedwithothercomponentssuchasendonucleaseorinhibitorcanbeanewmethodformodifyingandregulatingthegenomeofcreature.Thistechnologyhelpsusbetterartificiallymodifycreature,andalsoprovidesanewapproachtothetreatmentandpreventionofhumandiseases.Keywords:TALE;Modify;Regulate;Genome;GeneExpression;Biotechnology对于基因组的定点修饰技术，一直以来都是生物界所研究的热点。20世纪80年代末诞生了第一个基因敲出的小鼠模型，科研工作者从此能够选择性修改载有生命密码的基因组，探讨基因的功能。然而，这项技术停滞了20年之久，这项技术只能在少数2几种生物中进行，而且成功率也不是很高，而21世纪初的人工核酸内切酶技术的出现完善使这个梦想逐步成为现实。目前主要的基因操作技术是通过人工核酸内切酶进行的，目前主要包括3种类型：锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease,ZFN)、类转录激活因子(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)以及人工的大范围核酸酶(Meganuclease)。80年代末ZFN技术一度给人们极大的鼓舞，让人们看到了在基因操作上的希望。2009年，来自于美国和德国的两个研究组同时报道，类转录激活因子效应物就是这样一类蛋白质，其motif与核酸靶序列有极强的对应性。本论文主要对基于TALE基因修饰最新研究进展(Cermak,Doyleetal.2011,Clark,Voytasetal.2011)。TALEN既能够像ZFN一样急缺的修饰复杂的基因组，有比起具有容易设计等优点，对于遗传学的基础理论研究和应用研究来说，无疑是一个重大的飞跃，由于在TALEN组装技术和模式动物应用上的突破，EEN介导的基因编辑技术在2012年1月被NatureMethods杂志评选为2011年最受瞩目、最有影响力的年度生命科学技术，2012年12月被Science杂志评选为2012年度的十大科学进展之一。Science在评书中还把TALEN称为基因组的“巡航导弹”，还大胆预测TALEN技术将称为所有分子生物学实验室都要掌握的基本实验技能。本文将从TALEN的结构、构建及其应用等方面介绍TALEN的研究进展(Clark,Voytasetal.2011,Deng,Yanetal.2012)。TALE:一类黄单胞菌Ⅲ型效应蛋白TALE蛋白家族来自于一类特殊的植物病原体—黄单胞杆菌(Xanthomonasspp.)。早在1989年，人们就发现了该家族的第一个成员AvrBs3(Schornack,Meyeretal.2006)。TALE蛋白类似于真核生物的转录因子，它可以通过识别特异性的DNA序列调控宿主植物内源基因的表达，从而提高宿主对该病原体的易感性。在植物病原细菌与植物互作过程中，将其Ⅲ型效应蛋白(TypeⅢSecretionEffector,T3SE)分泌到植物细胞中是病原细菌致病的一种重要机制(Frank,Skryabinetal.2013)；效应蛋白在植物中可以扰乱寄主防卫反应或激活寄主植物的感病基因而使植物感病，病原细菌则通过此过程获得营养。在黄单胞菌(Xanthomonas)中，已知的T3SE以及候选因子分布在大约40个T3SE相关组中。在黄单胞菌中已经鉴定出大量的T3SE，其中最重要的一类为TALE(Transcriptionactivation-likeeffector),这类蛋白在发现之初被称之为AvrBs3(AvrBs3/PthA)(Schornack,Meyeretal.2006)家族。不同的TALE作用的寄主靶标不同，影响寄主的胜利过程。黄单胞菌中的TALE具有80%-97%的同源性，其具有以下特征：(1)N端高度保守，Ⅲ型分泌系统的分泌信号存在其5`-mRNA上;(2)中间区域是几乎一样的以34个氨基酸为一个重复单元的重复序列，不同蛋白间的差异主要存在于重复单元的重复数目上(0.5-33.5个)；(3)在C端含有亮氨酸拉链(Leucinezipper,LZ)、核定位信号(Nuclearlocalizationsignal,NILSs)和酸性转录酶激活区域(Acidicactivation,AD);(4)在重复单元中，第12和13位的氨基酸存在不同(图1A)。目前TALE蛋白晶体结构目前已被解析出。研究发现，TALE在进入植物细胞核后，会同转录激活子一样使得植物的某些基因进行转录，比如一些感病基因或抗病基因(MoscouandBogdanove2009,Mahfouz,Lietal.2011,Nakade,Tsubotaetal.2014)，所以我们才把这类效应因子称为Transcriptionactivation-likeeffector(KayandBonas2009).密码的破译及人工合成的实现研究显示，TALE是通过特异性识别并结合到靶标基因启动子区域的DNA序列来激活相关反应的。而这种结合的特异性的是由于重复单元中第12和13位氨基酸(Repeat-variabledi-residue,RVD)和其结合的DNA碱基序列存在一种不太严格的对3应关系。经过遗传学方法(Geissler,Hauberetal.2015)或生物信息方法(Gu,Yangetal.2005)的分析，当RVD为HD(组氨酸，天冬氨酸)时，其不严格对应的碱基为C(胞嘧啶)；当RVD为NI(天冬氨酸，异亮氨酸)时，为A(腺嘌呤)；当RVD为NG(天冬氨酸，甘氨酸)时，为T(胸腺嘌呤)；当RVD为NN(天冬酰胺，天冬氨酸)时，对应为G(鸟嘌呤)(图1B)。随着密码的破译，TALE被认为是一种全新的，优良的DNA特异性结合蛋白。为了能够获得结合任何目的序列TALE，多种种基于Ⅱ型限制性内切酶的合成技术被产生，他们实现了TALE的人工合成(Wah,Hirschetal.1997,Gu,Yangetal.2005,WhiteandYang2009,WernerandGossen2014,White2016)。这些合成方法的大致原理基本相同:首先合成对应不同碱基的重复片段，利用Ⅱ型限制性内切酶(BsmBI)使这些重复片段产生出多个两两匹配而又不改变氨基酸序列的粘性末端，然后再将多个片段进行连接(图2)。图1TALE结构及其结合特定DNA模式图(Boch,Scholzeetal.2009)Fig.1ModelforDNA-targetspecificityofTALeffectors.(A)TALeffectorscontaincentraltandemrepeats,NLSs,andanAD.ShownistheaminoacidsequenceofthefirstrepeatofAvrBs3.Hypervariableaminoacids12and13areshadedingray.(B)Hypervariableaminoacidsatposition12and13ofthe17.5AvrBs3repeatsarealignedto4theUPAboxconsensus(14).(C)RepeatsofTALeffectorsandpredictedtargetsequencesinpromotersofinducedgeneswerealignedmanually.NucleotidesintheupperDNAstrandthatcorrespondtothehypervariableaminoacidsineachrepeatwerecountedonthebasisofthefollowingcombinationsofeighteffectorsandexperimentallyidentifiedtargetgenes:AvrBs3/Bs3,UPA10,UPA12,UPA14,UPA19,UPA20,UPA21,UPA23,UPA25,AvrBs3Δrep16/Bs3-E,AvrBs3Δrep109/Bs3,AvrHah1/Bs3,AvrXa27/Xa27,PthXo1/Xa13,PthXo6/OsTFX1,andPthXo7/OsTFIIAγ1(fig.S1).Anasteriskindicatesthataminoacid13ismissinginthisrepeattype.Highestnucleotidefrequenciesareinbold.Nucleotidefrequenciesaredisplayedinalogo图2人工合成特异性TALE流程图(Li,Huangetal.2011)Figure2.DesignandmodularconstructionofdTALENs.(A)TALENrepeatgenesetsformodularconstructionofmulti-repeatTALENgenes.Eachsetcontainsfoursingle-repeatgeneseachencodingoneofthefour‘core’TALENrepeatmodulescontainingNI,NG,NNandHDRVDswithbindingspecificityforA,T,GandCnucleotides,respectively.Thecorerepeatsineachset(boxed)containsa5′-and3′-terminiuniquetothatparticularset—aslistedintheinsettable.Forconstructi