基因工程2

第四章核酸的定量和纯度检测提取的总DNA、RNA或载体DNA，外源目的DNA片段，必须对其浓度、纯度、构型、分子量大小等基本情况进行了解，以下几种方法从不同角度对DNA或RNA进行了鉴定。第一节紫外光谱分析法核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在260nm波长时，用标准样品测得每毫升l微克DNA钠盐溶液的吸光度值为0.02，即在1OD值相当于双链DNA浓度为50ug/ml，单链DNA或RNA为40ug/ml，单链寡聚核苷酸的含量为30ug/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度。DNA浓度计算：根据经验数据，若OD260=l时，dsDNA的浓度为50微克/毫升，假如质粒样品pBR322稀释500倍，测得光吸收值为0.025，则该样品pBR322浓度为50*0.025*500=625微克/毫升。分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8，纯净RNA的比值为2.0。若DNA的比值高于1.8，说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低，此时，可通过苯酚-氯仿-异戊醇方法抽提后再检测，以排除蛋白质的影响。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。优点：使用UⅤ-240紫外分光光度计测定DNA的方法简便、快速。注意的问题：1）用UⅤ-240可以通过260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280）估计核酸的浓度和纯度，但不能区分DNA的超螺旋、开环、线状三种构型，也不能区分染色体DNA。由于测定OD260时，难于排除RNA，染色体DNA，以及DNA解链的增色效应等因素，因此测得的数据往往比实际浓度偏高。2）用UⅤ-240，有因样品槽大，测定用量较多的缺点，但对于测浓度较高的样品，特别是测定寡聚核苷酸的浓度其效果甚佳。其他DNA多数选用琼脂糖凝胶法进行鉴定。3）紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。第二节溴化乙锭-标准DNA浓度比较法测定DNA浓度DNA本身不产生荧光，但荧光染料溴化乙锭(EB)嵌入碱基对之间后，可在紫外线激发下发出红色荧光。不同浓度的DNA溶于一定浓度的溴化乙锭溶液中，在紫外灯下所发射荧光的强度与核酸含量成正比，使用一系列已知浓度的DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA样品的浓度。特点：仪器设备与操作都很简单，省时，配制一套标准浓度的DNA样品与试剂存于-20℃，随时可进行测定比较。克服了UⅤ-240用量大的缺点，只需lul的用量，就可测出lng的DNA样品。适合于测定经过分离纯化后的DNA片段浓度，为DNA的重组连接提供浓度参数。在基因操作中，对于DNA含量较少，特别是要对分离纯化后的DNA片段的浓度进行测定，用此比较法最为合适。此法直接简便，测定量仅需0.5~1微升就能比较出确切浓度，灵敏度可达l~5ng。影响实验结果的因素：1）本实验对样品中含有的染色体DNA、RNA以及质粒DNA的三种构型无法区分；若待测样品不纯，测得的浓度比实际浓度肯定偏高。2）实验采用比较法，操作者的目测误差也影响准确性。3）DNA浓度大于20ng/ul以上时浓度误差较大，需要样品稀释到合适的浓度才能进行比较。第三节DNA的凝胶电泳带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。电泳技术是l9世纪初发明的，人们采用各种材料作为支持电泳介质，其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳最为突出。凝胶电泳的原理比较筒单。当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。即电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶等，电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。应用凝胶电泳技木分离DNA片段的基本原理：在一定生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，核酸分子在电场中向正电极方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度(亦即电泳的迁移率)取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子具有较紧密的构型，其电泳迁移率快，而且比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。一、水平式琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，又不吸附被分离物质，因此它是一种很好的凝胶剂。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。有两种不同类型的琼脂糖凝胶，一种是常熔点的，另一种是低熔点的（熔点为62~65℃的琼脂衍生物），它一旦熔解，便可在37℃持续保持液体状态达数小时之久，而在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。经化学修饰的低熔点(LMP)的琼脂糖在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备电泳，但价格却相当昂贵。原理：溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外灯照射下拍照，只需要5~10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ug的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知待测样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。一般情况下，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢的为开环状(OC)分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增强而提高分辨率。影响琼指糖凝胶电泳DNA迁移速率的因素：1．DNA的分子大小：线状双链DNA分子在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目以10为底的对数值成反比。分子越大，则摩擦阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2．琼脂糖浓度：一个给定大小的线状DNA片段，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同。DNA电泳迁移率()的对数与凝胶浓度()成线性关系,可用如下等式表示：lg=lg0-Kr，其中0为DNA的自由电泳迁移率；Kr是回归系数，是一个与凝胶的性质、迁移分子的形状和大小有关的常数。在大孔径的琼脂糖凝胶(即琼脂糖含量低的凝胶)中，凝胶对不同大小的DNA分子，其阻滞程度差异不大，而DNA分子的迁移率更多地依赖于分子的净电荷，因此对较小的DNA分子群得不到很好的分离效果。如果增加琼脂糖凝胶的浓度，可在一定的程度上降低电荷效应，使DNA分子迁移速度的差异主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定。但高浓度的琼脂糖凝胶电泳，所需时间长，因此通常根据待测分子量范围选择合适浓度的凝胶。也要根据每次电泳的不同要求，选择不同大小的电泳槽与合适的条件。3．DNA的构象：分子量相同的超螺旋型、带切口环状及线状DNA通过凝胶时速度不一。这三种DNA的相对迁移率主要取决于凝胶的琼脂糖浓度，也受电流强度、缓冲液的离子强度及超螺旋型DNA超螺旋度的影响。在某些条件下超螺旋型DNA迁移速率比线型DNA快；在另一些条件下则恰恰相反。4．所加电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。随着电场强度的增加，高分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，不再与电压成正比。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不应超过5V/cm。5．电场方向：如果电场方向保持不变，则大于50~100kb的DNA分子在琼脂糖凝胶上的迁移速率相同。如果电场方向改变，则DNA分子被迫改变路径。由于DNA分子越大，为适应新的电场方向而重新排列所需的时间越长，因此可以通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA分子(达到10000kb)。6．碱基组成与温度：DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为受DNA的碱基组成或凝胶电泳温度的影响不明显。不同大小的DNA片段的相对迁移率在4℃与30℃之间不发生改变。电泳一般在室温下进行。但浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶和低熔点琼脂糖凝胶较为脆弱，最好在4℃下电泳。7．嵌入染料的存在：荧光染料EB用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA，它会使线状DNA的迁移率降低15%。染料嵌入到堆积的碱基对之间，并拉长线状和带切口的环状DNA，使其刚性更强。8．电泳缓冲液的组成：电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如凝胶中未加缓冲液)，电导率最小，即使DNA还能移动一点的话，也很慢。在高离子强度的缓冲液中(如误加了10倍电泳缓冲液)，电导很高并明显产热。最坏的情况是引起凝胶熔解而DNA发生变性。有几种不同的缓冲液可用于天然双链DNA的电泳。这些缓冲液含EDTA(pH8,0)和Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)。其浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。电泳缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。最常用的缓冲液是TAE。但它的缓冲容量相当低，长时间电泳会使其缓冲容量丧失殆尽(阳极呈碱性，阴极变成酸性)。在进行高压、长时间的电泳时，更新缓冲液或在两槽之间进行缓冲液循环是可取的。TPE和TBE比TAE成本稍高，但它们的缓冲容量明显较高。双链线状DNA片段在TAE中的迁移速率比在TBE或TPE中快将近10%，但这些系统的分辨能力几乎相同，只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率要比在TBE中更好。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝，呈蓝紫色，分子量为670道尔顿，在不同浓度凝胶中迁移速度基本相同，分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与lkb、0.6kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯腈，呈蓝色，分子量为554.6道尔顿，携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢。根据分离样品中DNA分子的大小，可以参照指示剂溴酚蓝和二甲苯腈的迁移情况决定是否停止电泳。指示剂一般加在电泳上样缓冲液中，为了使样品能沉入胶孔，还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加密度。在凝胶电泳