基因工程与食品产业

1第二章基因工程与食品产业1.基因研究的发展过程1.1基因学说的创立1.2基因与DNA分子2.基因工程的概念及主要内容2.1基因工程的概念基因工程也就是DNA重组技术，是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成重组体，然后再把重组体引入宿主细胞中得以高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。2.2基因工程的主要内容概括起来，基因工程的操作过程一般分4个步骤，如图，第一步，获得目的基因并制备载体（质粒、病毒或噬菌体）；第二步，把获得的目的基因与制备好的载体用DNA连接酶连接组成重组体；第三步，把重组体引入宿主细胞；第四步，筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。3.工具酶和基因载体3.1基因工程的工具酶（1）限制性内切酶限制性内切酶的定义：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3‘-OH基团和5’-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。至今发现的限制性内切酶有三种类型，各具特性，基因工程操作中真正有用的是II型酶。II型限制性内切酶的命名命名原则一般是以酶源生物的属名和种名前1、2个字母以及株(型)代号来命名。如果从同一种生物中先后分离到多种限制性内切酶，则依次用罗马数字表示。举例：EcoRI中的Eco表示从大肠杆菌(Escherichiacoli)中分离出来的，R代表大肠杆菌的R株，I表示从中分离出的第一种限制性内切酶。从流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)菌株d中分离出来的第三种限制酶，被命名为HindIII。II型限制性内切酶的识别序列：限制性内切酶在双链DNA上能够识别的核苷酸序列被称为识别序列。多数限制酶的识别序列由6个核苷酸对组成。少数限制酶的识别序列由4个或5个核苷酸对组成，或者由多于6个核苷酸对组成。限制性内切酶识别序列的共同规律：呈回文结构，即序列被正读和反读是一样的。II型限制性内切酶的酶切位点：DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点，可用￬表示。限制酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部，如G￬GATCC、AT￬CGAT等。少数在两侧，如￬GATC、CATG￬等。(2)DNA连接酶DNA连接酶：能将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。该酶催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，将DNA单链缺口封合起来。DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口，而不能封闭裂口。粘性末端DNA片段的连接：具粘性末端的DNA片段的连接比较容易，也比较常用。2但是，在连接反应混合物中，具有粘性末端的载体DNA分子会发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构。这样，就会使只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大幅上升，最终给重组DNA分子的筛选工作带来麻烦。用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5’磷酸基团，可以克服这一缺点。平末端DNA片段的连接：1)同聚物加尾法：利用互补的同聚物序列之间的退火作用完成的连接。其核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶（能够在无模板链的情况下，将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3‘-OH基团上）转移核苷酸的特殊功能。2)接头连接法：DNA接头，是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。(3)DNA聚合酶DNA聚合酶：具有催化DNA体外合成反应作用的酶称为DNA聚合酶。这类酶的特点在于，能够把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶作用时大多都需要模板，合成产物的序列与模板互补。3.2基因工程载体理想的基因工程载体应具备的特征：(1)具有复制起点，能携带外源DNA片段进入受体细胞，进行稳定的DNA自我/同步复制(2)具有标记基因(3)具有若干限制酶的单一识别位点(4)具有较高的外源DNA的载装能力3.2.1质粒载体3.2.1.1质粒的一般生物学特性环形双链的质粒DNA分具有三种不同的构型：共价闭合环形DNA；开环DNA；线形DNA。质粒DNA的复制类型：根据寄主细胞所含拷贝数的多少，可将质粒分成两个不同的复制型：一种是低拷贝数的质粒（1-3份拷贝），称为“严密型”复制控制的质粒；另一种是高拷贝数的质粒（10-60份拷贝)，称为“松弛型”复制控制的质粒。拷贝数的常用定义：生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。一种质粒究竟是属于严密型还是松弛型并非绝对的，还受到寄主的控制。例如，R1质粒大肠杆菌寄主（严密型）、奇异变型杆菌寄主（松弛型）。3.2.1.2质粒载体的构建及重要的质粒载体为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的选择记号，又具有低分子量、高拷贝等优点的新的质粒载体。如pBR322质粒载体3.2.2噬菌体类载体若要构建一个基因文库，往往需要克隆更大一些的DNA片段。为满足这一要求，人们把噬菌体发展成为一种克隆载体。噬菌体高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增，因而噬菌体能被开发成基因工程的有用载体。噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。其基因组中有部分基因为非必要基因，被外源基因取代后，并不影响其生命功能。这是赖以发展作为基因克隆载体的一种重要特性。噬菌体载体的主要类型：噬菌体包装的上下限：50.5-37kb。构建噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除和切除掉非必要的区段。构建出的派生载体，可归纳成两种类型：3一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，称为插入型载体；另一种具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可被外源插入的DNA片段所取代，称为取代型载体。柯斯质粒载体：是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的质粒载体。柯斯质粒载体的特点：具有λ噬菌体高效转导的特性、具有质粒载体自我复制的特性、具有高容量的克隆能力。四、基因工程的基本技术4.1目的基因的获得目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。获得目的基因的途径获得目的基因有多种方法，目前采用的方法主要有限制性内切酶酶切直接分离法、PCR扩增法和化学合成法、cDNA基因克隆等。cDNA基因文库构建步骤：第一步：分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的分部；第二步：合成第一链cDNA；第三步：将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子；第四步：将合成的双链cDNA重组到质粒载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。4.2重组DNA向受体的转化（1）受体细胞受体细胞也叫宿主细胞，从实验技术上讲是能摄取外源DNA，并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值或理论研究价值的细胞。（2）重组DNA导入受体细胞的途径转化：通过生物学，物理学和化学等方法使外源裸露的DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。1)直接转化法有的微生物细胞在不加任何处理的情况下，就能直接摄取外源DNA。2)化合物诱导转化法用二价阳离子处理某些受体细胞，可以使其成为感受态细胞，即处于能摄取外源DNA分子的生理状态的细胞。这是实验室中常用于微生物的一种转化方法。3)接合转化法接合转化是通过供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒提供的。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。此方法主要用于微生物细胞的基因转化。4)电穿孔转化法也称为电转化，即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。该法具有简便、快速、效率高等优点，可用于真核细胞和原核细胞的外源DNA的直接导入。5)超声波处理转化法超声波处理细胞时可击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA进入细胞。此法的转化率较高，并且对细胞损伤较小，有利于细胞的存活。主要用于微生物细胞的基因4转化。6)激光微束穿孔转化法激光是一种很强的相干单色电磁射线，利用激光微束照射受体细胞，可导致细胞膜的可逆性穿孔。基本做法是，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源进行照射，导致细胞膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA随之进行细胞。此法操作简便快捷，转化率高，无宿主限制。可对线粒体和叶绿体等细胞器进行基因操作。7)体内注射转化法利用显微注射仪把外源DNA直接注入受体细胞的转基因方法。此法操作较为繁琐耗时，但其转化率很高，可用于动植物的外源DNA的转化。8)脂质体介导转化法脂质体法是根据生物膜的结构和功能特征，用磷脂等脂类化学物质合成的双层膜囊将DNA包裹成球状，导入原生质体或细胞，以实现遗传转化的目的。此法的优点是可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用、降低对细胞的毒害效应、适应的动植物种类广泛、重复性好。9)磷酸钙-DNA共沉淀法核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，导致细胞非特异性内吞。具体作法大致是：先将需要被导入的DNA溶解在钙盐溶液中，然后在不停地搅拌下逐滴加到磷酸盐溶液中，形成磷酸钙微结晶与DNA的共沉淀物。再将这种共沉淀物与受体细胞混合、保温，DNA可以进入细胞核内，并整合到寄主染色体上。10)根癌土壤农杆菌Ti质粒介导的转化法根癌农杆菌是使受感染植物形成冠瘿瘤的病原因子。根癌农杆菌中含有一种大的Ti质粒，其中具有一组控制植物激素基因。构建有效的植物转化系统：载体为Ti质粒，宿主为根癌农杆菌，通过根癌农杆菌感染受体植物，将Ti质粒上的目的基因转入植物细胞。此法简单易行，受体范围广。目前绝大多数双子叶植物转基因技术都是通过该技术完成的。11)基因枪转化法利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒进入细胞的转化方法。此法简单快速，可直接处理植物组织，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围。12)花粉管通道转化法基本操作过程：植物授粉过程中，将外源DNA涂在柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。此法操作简便，成本低，适合普及应用等优点，具有一定的应用前景。4.3重组子的筛选与鉴定（1）重组子的筛选①根据载体表型特征筛选重组子基因工程中使用的所有载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。这种遗传选择法，使我们能够将重组的DNA分子同非重组的亲本载体分子区别开来。抗药性记号的插入失活作用便是属于这种依据载体编码的遗传特性选择重组子的典型方法。②根据插入序列的表型特征筛选重组子基本原理：转化进来的外源DNA编码的基因，如果能够对寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，就能使被转化的寄主细胞表现出对外源基因编码的表型特征。③根据报告基因筛选重组子基本原理：由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此识别重组体。5报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。（2）重组子的鉴定①根据重组DNA分子特征鉴定重组子：重组DNA分子大小、重组DNA分子限制性内切酶酶切图谱、PCR扩增片段、DNA杂交法、DNA核苷酸序列。②根据目的基因转录产物(mRNA)鉴定重组子从外源基因转录的产物mRNA水平鉴定重组子主要采用的是Northern杂交法。其过程与Southern杂交类似，不同的是用DNA探针检测RNA分子。基本方法：从重组子中提取总RNA，用亲和层析原理纯化出mRNA，经电泳，将电泳凝胶中的RNA转移到供杂交的膜上，用DNA探针杂交，出现阳性杂交带的重组子就是外源基因能有效转录的重组子。③根据目的基因翻译产物鉴定重组子原理：如果能检测到重组子中目的基因的翻译产物，表明该重组子是含有目的基因的重组子。方法：凝胶电泳检