基因工程作业

1.比较克隆载体和表达载体的异同点？同：1）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞；2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3）具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；4）具有合适的筛选标记。异：1）表达载体在克隆载体的基础上又增加了基因表达的调控元件：即启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号（区分二者的标志）2）克隆载体在菌体中一般是多拷贝的，而表达载体一般是低拷贝的。2.什么是限制性内切酶？能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA双链的核酸内切酶。生物学功能：1，保护自身的DNA分子，不受限制（修饰的甲基转移酶）；2，抵御“外来”DNA分子的入侵，迅速使之降解（核酸内切限制酶）。类型：I型酶（无用）、II型酶（常用工具酶）、III型酶（用处不大）其中，II型酶基本特性：1，在DNA分子双链的特异序列识别并切割导致链的断裂；2，两条链断裂的部位在DNA分子上的分布，通常不是直接相对的，因而会形成互补的链延伸末端。少数酶切割后产生平末端。3.载体具有哪些基本特性？1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)；2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；4.具有较高的外源DNA的载装能力；5.具有合适的筛选标记。4.PCR的反应步骤及原理？答：基本原理：PCR技术是以DNA互补链的聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸,最终获得特异DNA片段的体外扩增方法。步骤：变性：系统加热至92℃-96℃，使dsDNA解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质；退火：降温至37℃-72℃，使引物与模板的互补区相结合；延伸：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。5.抑制性差减杂交的原理与应用？SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；抑制性PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。6.基因文库的基本条件，构建步骤？基本条件：1.重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力；2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；4.克隆片段易于从载体分子上完整卸下；5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；6.具有较高的完备性。构建步骤：1.基因组DNA的制备：为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂；2.基因组DNA的切割：用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；第二，保证DNA片段大小均一。3.载体和受体的选择：出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ-DNA或考斯质粒；4.基因文库构建的技术性问题：在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：避免外源DNA片段之间的连接。7.α互补？宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫互补在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有B－半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码序列；在这一编码区中插入有一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶的氨基端，而不影响功能；宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。由α互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTG的存在下可与生色底物X-gal反应，因此Lac＋细菌在含X-gal和IPTG的培养基上可形成蓝色菌落，易于识别。当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无α互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。8.基因重组的步骤？1.目的基因的获取(获取目的基因是实施基因工程的第一步。)目的基因来源可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成，获取目的基因的方法:①从基因文库中获取(基因组文库，部分基因文库)；②利用PCR技术扩增目的基因(变性，复性，延伸)；③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成；2.基因表达载体的构建(基因工程的核心)基因表达载体的组成:目的基因、启动子、终止子、标记基因；3.将目的基因导入受体细胞；4.目的基因的检测与鉴定。9.外源基因在大肠杆菌中的表达形式有哪些？如何纯化？1）包含体蛋白：纯化步骤：细胞收集与破碎，洗涤与溶解，变性蛋白质的纯化，重组蛋白质的复性，天然蛋白质的分离。2）融合蛋白：融合蛋白的提取，重折叠，纯化，天然蛋白的回收以及蛋白质的水解保护。3）分泌型蛋白：首先要进行浓缩处理，然后再根据发酵液中的有效成分和杂质之间的理化性质存在的差异来考虑选择合适的纯化方法。如离子交换层析，亲和层析，凝胶过滤等。4）可溶性表达产物：经细胞破碎后的可溶性离心上清液，可利用如果有可利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，，可选用亲和层析分离法。对处于极端等电点的蛋白，采用离子交换层析分离。5）周质表达蛋白：大肠杆菌细胞低浓度溶菌酶处理，渗透压裂解法，周质腔分离出目的蛋白。10.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ与klenow片段的比较答：1）结构上的区别：Klenow片段是完整DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，是用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，得到的两个片段中分子量较大的一个，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'的外切酶活性，不含5'→3'外切酶活性。2）功能上的区别：DNA聚合酶I可通过DNA缺口平移的方法制备DNA探针。而klenow酶主要用于缺口平移标记DNA，也用于DNA的缺口补平和延伸。还在cDNA克隆中用于第二条cDNA链的合成。11.基因组文库与cDNA文库的区别基因组文库：基因组文库简称基因文库，是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后获得的重组子群体的总称。CDNA文库：是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了全部表达基因的转录本。区别：基因组文库包含全部基因，但cDNA文库石油mRNA反转录得到的，，已经去掉基因中的内含子部分16.双脱氧链终止法基本原理、方法：答：基本原理：在DNA聚合酶的作用下，双脱氧核苷酸分子可以象正常核苷酸一样参与DNA合成；但是，由于它自身3′位置-OH的缺失，至使下位核苷酸的5′磷酸基无法与之结合，从而导致反应终止，并产生长度不一的DNA片段。通过凝胶电泳分离，放射自显影确定DNA片段末端的碱基，进而推断DNA的核苷酸序列。方法：该方法以待测DNA为模板，在DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA链；反应体系中除含有四种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)外，加入了一种双脱氧核苷酸(*ddATP或*ddCTP或*ddGTP或*ddTTP)。在DNA合成过程中，标记的*ddNTP将与相应的dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中。如果是dNTP掺入其中，DNA互补链则将继续延伸下去；如果是*ddNTP掺入其中，DNA互补链的合成则到此终止.而双脱氧核苷酸的掺入是随机的，故各个新生DNA片段的长度互不相同。经聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影，读取DNA的碱基排列顺序。13.影响限制性核酸内切酶酶活性的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）消化反应的缓冲液系统（4）DNA的分子结构（5）酶切消化反应的温度（6）酶的纯度（7）酶的星号活性12.转基因的安全性问题从两方面论述1、抗性选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质，或者编码出的蛋白质所具有的催化功能对宿主的代谢具有潜在毒性作用，并出现滞后效应或长期效应。2、转基因植物可能会表达出过敏蛋白；有的基因表达出的蛋白质与已知的过敏蛋白质在免疫学上具有同源性；有的基因表达的蛋白质家族中的某些成员是过敏蛋白，它们都有可能是过敏体质的人产生过敏反应。3、转基因农作物表达出的某些蛋白质，可能会潜移默化的影响人的免疫系统，从而对人体健康造成隐性的损伤。4、改变农作物品质的基因及其表达产物，可能会改变宿主体内的代谢途径，从而改变转基因食品的营养成分。5、科学家赋予了转基因生物某些全新的性状，增强了它们与其他生物的生存竞争能力，它可能会使本地区本来生活力就很纤弱的个体或物种加速从地球上消失。即转基因生物可能会成为某一地区新的优势种，成为“入侵生物”。6、载体介导的外源基因可能发生横向转移，重组出新的菌株或病毒。7、具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可能使害虫产生抗性，使害虫变得更加难以防治？现在也已发现具有抗病毒功能的转基因植物，可以使相应的病毒出现抗性。8、转基因植物可能会变成野生种类，或者它侵入新的生态区域，破坏了生态平衡后而成为杂草。9、改变了生物的多样性和群落结构，生态系统的稳定性可能会遭到破坏。转基因生物是自然界中不存在的“人工制造”的生物，它们所具有的强大的生存竞争将使处于脆弱平衡状态的农田生态系统等遭到破坏。10、转基因植物中，如含有对人体有害蛋白或过敏蛋白的花粉，有可能通过蜜蜂采集进入蜂蜜中，最后再通过食物链进入人体14.纯化质粒DNA提取的基本原理（1）溶液I【50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0】重悬含质粒的大肠杆菌细胞，用溶菌酶裂解大肠杆菌细胞，利用Mg2+螯合剂---EDTA抑制核酸酶活性，使DNA分子不被降解（2）加入溶液II【0.2NNaOH/1%SDS】使宿主细胞进一步裂解，使染色体和蛋白质变性（3）加入pH4.8的3mol/L乙酸钠起中和作用，使共价闭合质粒DNA复姓，而线性染色体DNA聚集成不可溶的网状复合物，并使蛋白质—SDS复合物以及高分子质量的RNA分子沉淀，通过离心收集上清液，用乙醇沉淀法收集质粒DNA15.基因库与基因文库区别：基因库：特定生物体全基因组的集合（天然存在）；基因文库：将特定生物个体的全部DNA片段连接入载体DNA分子上，并导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因组序列的克隆群体。（人工构建）。18.转化率的计算例题：某一DNA重组实验的充足率为20%，转化率为107/mg载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体低约100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少载体DNA进行重组实验？解答：若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要104/(107*10-2)=0.1mg载体DNA,重组率为20%时投入载体为0.1/20%=0.5mg，载体投入量确定后，即可按10:1的要求算出5mg。17.同聚物加尾法和衔接物连接法的优缺点比较133同聚物加尾优点：(1)首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。衔接物连接法优点：此法是进行DNA重组的一种既有效又实用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优点，而且它可以根据实验的不同要求，设计出具有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端DNA片段间的连接效率。