搜索
一、RNA提取与检测：1、原理：采用Trizol法提取总RNA2、试剂及作用:（1）TRIZOL：是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。（2）DEPC：中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，常用于生物实验中RNA的提取等。（3）氯仿：一般指三氯甲烷，遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气（碳酰氯）和氯化氢。常加入0.6%～1%的乙醇作稳定剂。氯仿在实验中虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。（4）异丙醇：一种有机化合物，正丙醇的同分异构体，别名二甲基甲醇、2-丙醇，异丙醇的作用是在氯仿作用后使RNA沉降下来形成，加入后离心管中会产生沉淀。其优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带可能会不清楚。缺点是加入后难以挥发。（5）75%乙醇：作用是清洗沉淀下来的RNA（6）DEPC处理过的水：用于处理实验过程中的用具，防止RNA降解，另外最后一步中用于溶解RNA。3、注意：(1)整个实验过程中都要戴手套，口罩，最好在冰上进行操作，严防外界RNA酶降解RNA。(2)液氮研磨时，应使用预冷的研钵，植物材料应剪碎，加入液氮后待研钵中再无气泡冒出后迅速研磨，一定要研磨充分。(3)提取的总RNA应保存在-20摄氏度的冰箱。4、提取的总RNA检测：提取的总RNA可通过琼脂糖凝胶电泳做检测，如果电泳显示4条带即28S，18S，5.8S,5S的RNA条带，四条带完整且28S的条带亮度是18S的两倍，则认为提取RNA质量较好，若有弥散条纹出现，则RNA部分降解。另外还可以用核酸测定仪对提取的总RNA进行含量测定。二、RT-PCR及电泳：1、原理：RT-PCR即反转录PCR，是以反转录的mRNA做模板进行的PCR反应.原理是利用反转录酶，mRNA模板，特异引物，dNTP等反转录得到目的基因的cDNA第一链，然后扩增得到目的cDNA。PCR反应步骤：（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。（3）引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。PCR引物的选择：（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。（2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。（3）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3’末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。2、试剂及作用：(1)mRNA模板：反转录的模板(2)oligo(dT):oligo多聚体,用于反转录，绝大多数mRNA3’端有poly(A)尾巴，oligo与其相配对，其作用相当于mRNA引物。(3)M-MULV反转录酶:莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶。(4)dNTP：脱氧核苷酸(5)PCR特异引物：引物GAPDH1-1，GAPDH1-2可以扩增目的基因。(6)反转录缓冲液：提供缓冲体系(7)TaqDNA聚合酶：合成cDNA第二链3、注意：(1)PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。(2)双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。(3)复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。4、检测：可对PCR产物跑胶检测。三、质粒提取及检测:1、原理：实验采用试剂盒提取质粒，实际相当于碱裂解法提取质粒。在用试剂盒提取核酸时，所用柱子低PH高盐时，核酸会结合到柱子上；洗脱时所用的EB溶液是提供高PH低盐的环境，使核酸溶解。EB也可用水来替代，但要调整PH值。在使用EB时，可适当加热。2、试剂及作用：（1）P1:相当于溶液1，含50mM葡萄糖，25mMTris-Cl，10mMEDTA，pH8.0，作用是悬浮大肠杆菌。（2）P2:相当于溶液2，0.2NNaOH/1%SDS溶液，作用是裂解细胞，释放质粒。NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer结构向micelle结构的相变化所导致。裂解时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂。（3）P3：相当于溶液3，3M醋酸钾与2M醋酸。作用是沉降基因组DNA与蛋白，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，而且大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。2M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。3、注意：(1)不要忘记第一步的柱平衡。(2)洗脱液EB可以预热，洗脱可以重复两次。4、检测：可用琼脂糖电泳进行质粒DNA鉴定，一般能看到三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体。四、双酶切及回收：1、原理:(1)使用BamHI与SaII两种限制酶对质粒及目的DNA进行酶切，使用试剂盒推荐的配比及Buffer.(2)胶回收质粒时利用核酸在裂解液下与硅胶膜特异结合，在洗脱液条件下被洗脱的原理，使用硅胶膜来浓缩DNA片断。2、方法：(1)1μgDNA中添加10U的限制酶，在50μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。(2)溶胶时采用0.1g胶加入100ul溶胶EB。3、注意：(1)酶切时为防止星活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。(2)使用双酶切方法时须使用同一公司提供的限制酶。(3)紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片。(4)切胶时应戴眼镜，胶要包含所有DNA但要尽量小，紫外时间应该尽量短。(5)溶胶不完全的原因可能有：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥。(6)胶回收洗脱时可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，以增加洗脱效率。五、感受态制备：1、原理及方法：感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。2、注意：(1)使用的大肠杆菌要进行活化，并且一定要是处于对数生长期。(2)所有操作均应在无菌条件和冰上进行.(3)氯化钙应该使用新配制的。(4)一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比，因此可以适当提高质粒浓度。六、连接方法：1、原理：采用T4DNA连接酶连接外源DNA与质粒。外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶，因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。2、方法：粘末端的连接，带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物,而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度,以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉,最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连,产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入大肠杆菌受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。3、注意：(1)粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4DNA连接酶的最合适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。(2)在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。(3)DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。(4)在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。七、转化方法：1、原理：用氯化钙制备感受态细胞，加入外源质粒进行转化。2、方法：转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法如电击法,CaCl2等化学试剂法等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入总体积15％的无菌甘油于-70℃保存,因此CaCl2法为使用更广泛。3、注意：(1)操作过程应该一定要注意防止杂菌污染，因为感受态细胞无抗性，所以实验过程应格外注意。(2)用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的DNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细