基因工程原理与方法期末作业如何利用基因技术表达人干扰素

基因工程原理与方法期末作业如何利用基因技术表达人干扰素2012级生物科学3班赵秋毅201205131331.表达干扰素：一般利用诱生剂诱导白细胞表达干扰素，如促细胞分裂剂、脂多糖、人工合成的多聚体，如polyI:C和polyA:U，使细胞表达干扰素升高。2.核酸的提取：培养白细胞直接加入裂解液裂解，提取细胞总RNA。mRNA在细胞内半衰期极短，在体外也甚不稳定，应尽可能完全抑制或去除RNA酶活性。大多数真核生物mRNA的3’端有polyA尾巴，这样可把mRNA与其他RNA分离。3.获得靶基因：用逆转录试剂盒进行逆转录操作，把总mRNA逆转录成cDNA4.设计引物：设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内或5'-端最好有内切酶酶切位点。5.PCR扩增：以cDNA为模板、设计的特异的干扰素引物为引物进行PCR扩增，得到干扰素基因cDNA的扩增产物。6.构建克隆载体：利用pBR322质粒（俗称万能质粒。含有一个复制起点含AmprTetr），双酶切，再把经PCR扩增的cDNA两端加上人工接头，用DNA连接酶连接cDNA和pBR322。插入抗四环素基因中。7.导入感受态细胞：将重组质粒，通过电击/热击的方法，导入感受态的大肠杆菌。培养。8.克隆子筛选：平板筛选法。将转化菌先涂布在Amp的平板上培养，并将存活的菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就是已经插入了外源DNA片段的重组质粒。9.检验测序：碱裂解法提取重组DNA进行酶切，送专业机构测序，与原干扰素序列比对。并进行凝胶电泳检验。10.构建表达载体：鉴定序列无误后（含有无义突变也可），将鉴定合格的重组质粒、表达载体pET32a分别用相应的酶进行双酶切。pET32a包含的Trx标签不仅可以增强一些蛋白质的可溶性，也可以在trxB突变菌的细胞质中催化二硫键的形成。所表达的人干扰素含有二硫键并需要正确的立体结构，应该选用可溶性表达。11.将目的基因片段与原核表达载体pET32a连接。12.导入感受态细胞：将表达载体导入感受态大肠杆菌BL21系列。13.判断表达蛋白类型：在含有氨苄青霉素的培养基培养，加入诱导剂IPTG，继续诱导培养。破碎细胞，离心取上清，用SDS-PAGE分析诱导前后上清与沉淀中目标蛋白的分布情况，如在超声破碎后的上清中表明是可溶性蛋白，在沉淀中是包含体蛋白。人干扰素是可溶性蛋白。14.培养：把转化的细菌涂布到LB+Amp平板培养。具体条件环境略。15.从LB+Amp平板上随机挑选生长的单菌落。在培养液中继续培养16.破碎细胞（酶裂解、超声破碎），低温离心，回收上清。17.纯化：利用标签（His）进行亲和层析，可以使蛋白质纯化100-1000倍。18.分析检测：提取纯化后的干扰素，进行SDS-PAGE分析，并进行Western杂交（抗原抗体检测）19.浓缩：蛋白质由于过柱纯化而被稀释，需要用透析袋、冷冻干燥、超滤膜等方法浓缩。20.贮存：干燥制品在低温情况下活性可以保持数日至数年无明显变化。只要将干燥样品置于干燥器内（内有干燥剂）密封，保持0-4℃即可。