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基因工程期末复习最终整理精编版移动基因：又称为转位子，他能从染色体基因的一个位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跳跃，故称为跳跃基因，最早在玉米中发现，它又分为插入序列，转位子，逆转座子。基因工程：也叫基因操作或重组DNA技术，指重组DNA技术产业化的设计与应用。具体指在分子水平上，用人工方法提取不同生物的遗传物质，在体外切割拼接和重新组合，然后通过载体把重组DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制及表达，按照人们的需要生产不同的产物或定向创造生物的新性状并稳定的遗传给后代。例如：体内DNA突变，体外基因操作及基因化学合成等。凡是在基因水平上操作而改变生物遗传性的技术。基因工程包括上游技术及下游技术，上游技术指基因重组克隆和表达的设计与构造，下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养及基因产物的分离纯化过程。DNA重组：或称为基因重组是细胞内常发生的过程，它在物种变异进化及基因表达调控具有重要意义，广义的基因重组分三个水平，整体水平，细胞水平及分子水平。狭义的基因重组概念指分子水平上基因交换发生在同一染色体内或两个染色体之间进行，甚至一个生物体的基因插入另一个生物的染色体内，狭义上的概念为普通接受的概念。生物工程：又称生物技术，生物工艺或生物工业技术等，是一门应用生物科学及工程学的原理来加工生物材料，或用生物及其制备物来加工原料，以提供所需商品和社会服务的综合性科学技术。它是在整个生物领域改造生物并生产生物产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称。它包括遗传工程，细胞工程，酶工程，发酵工程及农业工程。克隆：指由一个细胞经过无性繁殖后形成的子代群体，因此，在基因工程中，克隆一词是指含有单一DNA重组体的无性系，或指将DNA重组体引入受体细胞中建立无性系的过程。基因库:指待定生物体天然存在得全基因组的集合。基因文库：从待定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在.基因工程的意义：1，基因工程大大加速了变异进程。2，克服了变异的盲目性并使变异定向化。3，打破了种属界限，实现了生个生物界的自由交流，使人类可以培育生物新品种，新类型及至创造新生物。克隆：当它作为名词使用时，是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代，或具有相同性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体；当克隆作为动词使用时，是指从同一祖先生产这类同一DNA分子群或细胞群的过程。克隆发展时期：1微生物克隆：细菌的复制2生物克隆技术：DNA分子克隆3动物克隆：克隆多莉羊。基因工程的关键问题：怎么得到有生产意义的目的基因元件。该实验的多层次多角度的体现：层次性：1.AP与Stri两种抗生素对转化子的筛选（表型特征）2.电泳片段大小的测定（DNA片段对比）3.菌落原位杂交（分子的同源性）4.电镜法看质粒形态（质粒分子超微结构观察）5.测序法看片段的碱基序列（DNA序列水平）多角度：菌落→电泳→原位杂交→测序方法：有简单→复杂，有粗犷→精细质粒结构：aDNA测序，b电镜照片（a,b是判断质粒存在的全标准）质粒功能：链霉素抗性的产生（酶结构，活性和功能的改变）复旦基因工程流程改进的要点：1.补充必要实验，提高流程的完整性2.调整有关实验步骤，加强流程的逻辑性。3.去繁就简，提高流程的效率性。Ⅱ型限制性核酸内切酶：其修饰与限活性由分开的两个酶完成，酶由二条太键构成。识别位点为4—6bp。其切割位点和Ⅰ酶相同，只对2条链都没有甲基化的DNA进行切割，对一条链甲基化的另一条链甲基化，对两条链都甲基化的不发生作用。影响限制性内切酶活性因素：1.DNA样品的浓度2.DNA样品的甲基化程度3.核酸内切酶的缓冲液性4.酶切消化反应的温度5.DNA分子的结构大肠杆菌DNA聚合酶的种类：DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ。PolⅠ及PolⅡ的主要功能是参与DNA的修复过程，而PolⅢ的功能同DNA复制有关，PolⅠ同DNA分子克隆有密切关系。DNA聚合酶共同点：它们都能把脱氧核苷酸连续的加到双链分子引物链的3`-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模版上解离的情况。PolI催化的聚合作用：是在生长链的3`-OH的末端基因团同参入进来的核苷酸分子之间发生的。DNA聚合酶工催化的DNA链的合成是按5`-3`方向生长的。星号活性：高浓度的酶高浓度的甘油，低离子强度极端PH值等回事一些核酸内切酶的识别和切割序列发生特异性及所谓的Staractivity现象。II型限制性核算内切酶：其修饰与限制活性又分开的两个酶来完成；酶由二条肽键构成。识别位点为4-6bp的回文结构切割位点：和类型工酶相同。只对2条链都没有甲基化的DNA进行切割；对一条链甲基化的只要使另一条链甲基化，对两条链都甲基化的不发生作用。识别切割位点：1，识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列2，大部分酶的切割位点在识别内部或两侧3，识别序列呈典型的旋转对称型的回文结构Klenow酶基本特点：大肠杆菌PolI经枯草杆菌蛋白酶水解，可得到大小两个片段，其中获得的N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶特点：仍有5`-3`的DNA聚合酶活性及3`-5`的核酸内切酶活性但失去了5`-3`的核酸内切酶活性。Klenow酶的基本用途：1，补平由核酸内切酶产生的5`粘性末端也就是修补3`隐蔽末端2，标记DNA片段的末端3，cDNA克隆中第二链cDNA的合成4，双脱氧末端终止法测定DNA序列核算修饰酶：TdT末端脱氧核苷酰转移酶基本特征：不需要模版的DNA聚合酶，随机惨入dNTPS.Mg2+催化为-端-OH`3-AAAOH`3Co2+催化加两端连接酶种类功能连接特点：1，种类根据来源由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶NAD+作能源辅助因子由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫T4DNA连接酶，用ATP作能源辅助因子，连接酶连接缺刻DNA的最佳反应温度是40C-250C2,功能及连接特点:DNA连接酶功能：在一条DNA链的3`末端具有一个游离的羟基和在另一条DNA的5`末端有一个磷酸基团的情况下，能催化两条DNA链之间形成磷酸二酯链。连接特点：DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架的切口，即在双链DNA的某一条链上的两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭缺口，即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。载体的功能：1运送外源基因高效转入受体细胞2为外源基因提供复制能力或整合能力3为外源基因的扩增或表达提供必要条件载体应具备的特征：1具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3具有较高的外源DNA的载装能力4具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点5具有合适的筛选标记质粒载体的构建与分类天然质粒的缺陷：分子量大、拷贝数低、酶切位点少、遗传标记不理想，不能满足克隆载体的需要，需要进行人工重新构建。几种野生型质粒：pSC101、Tcr、四环素抗性标记基因、ColEI、大肠杆菌内毒素标记基因、E1、RSF2124、Apr、氨共青霉素可行标记基因质粒载体的分类：（功能及用途分）高拷贝质粒载体、低拷贝质粒载体、温敏质粒载体、测序质粒载体、整合质粒载体、穿梭质粒载体、表达质粒载体大肠杆菌λ噬菌体λ噬菌体的生物学特性：1是E.coli的温和噬菌体2由外壳包装蛋白质和λ—DNA组成3λ—DNA全长48502个核苷酸、4至少有61个基因λ噬菌体基因组（示意图）四（10）由头部合成基因（头部区）、（cos）、调控区、重组区、尾部合成基因（尾部区）考期质粒与噬菌体考期质粒与噬菌体构建的原理：将噬菌体DNA包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度的缩短载体的长度，又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒。Cosmid载体的构建：考期质粒是一类人工构建的含有λ—DNAcos包装序列和质粒复制子的特殊类型的载体Cosmid的特点：1能像λ—DNA那样体外包装并高效的转染受体细胞2能像质粒那样在受体细胞中自主复制3重组操作简单、筛选容易4装载量大（31—45kb）5不能体内包装不裂解受体细胞人造染色体载体：将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，可构建染色图载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体一样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。常用的人造染色体：细菌人造染色体（BAC）、酵母菌人造染色体（YAC)、TACYAC的构造：含有以下原件酵母染色体复制子ARSI、酵母染色体着丝粒序列CEN4、酵母染色体端粒序列TEL、酵母系统的选择标记、大肠杆菌复制子、E.coli选择标记YAC载体的装载量为350—400kb图λ—DNA载体的构建加装选择标记，分为免疫功能累标记、颜色反应标记。加装选择标记imm434。imm434基因是一种阻止λ噬菌体进入溶菌循环的阻碍物。含有完整标记的λ载体进入受体后，imm434表达，建立溶原状态，细菌生长慢，形成浑浊斑。外源DNA插入标记基因时，基因灭活，λ—重组子进溶菌循环，透明斑。加装选择标记lac2.lac2基因编码β—半乳糖苷酶，催化无色的X—gal生产蓝色化合物。外源基因插入到laz基因中，基因灭活。不能合成蓝色化合物，为白斑。空载体λ—DNA则产生蓝色透明斑。构建琥珀密码子的突变体琥珀型突变是指由GAG向UAG的突变。将野生型入一DNA和E两个头部包装的蛋白的基因中的CAG密码子变成UAG，这种入—DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部，也就不能被包装和裂解，这样就可以阻止有害组体的生物污染及扩散。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编产物校正trRNA能专一性的纠正这一突变，相反基因工程用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株+基因文库的构建过程：1基因组DNA的制备2基因组DNA的切割从基因文库中筛选目的基因：1直接筛选2多轮操作文库克隆排序的方法：1酶切片段末端标记法2随机探针联合杂交法3染色体走读发从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0。5—2.0kb范围内。分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起，然后再以阳性克隆片段的两端序列为亚克隆探针连行第二步走读直至线型染色体DNA的端点。cDNA法一~构建cDNA文库克隆目的基因的策略提取组织细胞的全部mRNA，体外反转录成cDNA，连接适当的载体后转化受体菌，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合，称为该组织细胞的cDNA文库二~cDNA文库构建的基本程序1.细胞mRNA的分离纯化⑴第一步是分离提取细胞总RNA⑵然后过柱，从总RNA中纯化出总mRNA。2反转录合成；cDNA第一链的合成；cDNA第二链的合成；⑴自身引导法：获得的双链cDNA5＇断会有几对碱基缺失⑵置换合成法：缺点如⑴，⑶Lligo（dG）引导合成法：能保留完整的5＇端序列⑷PCR法3双链总cDNA构建重组载体；双链平头的cDNA，使用三种方法克隆入载体中：⑴cDNA双链加链接物连接法⑵载体引导和城cDNA构建重组载体⑶载体引导加接头连接构建cDNA的重组载体4cDNA重组载体导入手提细胞：总cDNA重组载体集合，导入众多细胞中。形成细胞的集合，重组细胞的集合就是cDNA基因文库。三、从cDNA文库中分离目的基因的方法1、完备分离程序：提取细胞mRNA，合成总cDNA，将之cDNA全部克隆，然后借助于合适的筛选的手段，打到目的重组子。筛选：多拷贝载体克隆，采用菌落原位杂交法;表达型载体克隆，采用菌落免疫杂交法筛选。适用：适用于mRNA丰度数少的基因的克隆（文库含全部cDNA基因）2、特异分离程序：提取总细胞mRNA；琼脂凝胶电泳分部分离，回收目标mRNA，此为特定长度富集片段；由此合成双链cDNA，然后进行克隆和建立cDNA文库，适用于mRNA风度极高的目的基因的克隆。（文库中含有部分特定的cDNA基因）3、差异分离