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1基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作限制：侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，从而保护自身DNA不被降解修饰：细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解粘性末端：指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构平末端：限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端同裂酶：识别相同靶序列的限制性内切核酸酶同尾酶：识别的靶序列不同，但切割后产生相同粘性末端的限制性核酸内切酶回文序列：双链DNA中的一段倒置重复序列星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性的现象（改变反应条件，导致限制酶的专一性和切割效率的改变的现象）双酶切：用两种不同的限制性内切核酸酶切割同一种DNA分子，从而产生DNA分子片段带有两个不同的末端DNA连接酶：能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两个末端连接在一起的核酸酶DNA聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸聚合的酶反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板，催化合成互补的DNA单链的聚合酶同聚物加尾：当反应混合物中只有一种脱氧核苷酸时，可形成仅有一种核苷酸组成的3’尾巴的反应基因工程的技术流程：1.目的基因的克隆；2.载体的准备；3.目的基因与载体的连接；4.重组DNA转化/转染/转导；5.重组体的筛选与鉴定；6.重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发利用基因工程的基本条件：1.目的基因（是开展基因工程的的目标和物质基础）；2.载体（外源基因不能自行复制，也很难稳定存在于受体细胞，所以需要载体）；3.工具酶（使DNA分子体外切割与连接成为可能）；4.受体细胞（是摄取外源基因重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细胞）基因工程的理论基础：遗传物质是DNA；DNA双螺旋结构的提出及半保留复制机制的揭示；中心法则的提出基因工程的技术基础：限制性内切核酸酶、连接酶的发现；载体的应用；大肠杆菌转化体系的建立核酸酶的分类：按裂解方式：外切核酸酶、内切核酸酶按核酸底物不同：RMA酶、DNA酶、底物非专一性核酸酶限制性内切酶的类型：Ⅰ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近的一些核苷酸上切割DNA分子双链，但切割核苷酸序列是随机的，无专一性，具有甲基化功能，需ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，为回文对称结构，并在识别序列固定位置上切割DNA分子，限制作用需要镁离子作为辅助因子（DNA重组技术最常用的工具酶）Ⅲ型酶：有专一的识别序列，但不为回文序列，切割位点据识别位点24~26bp，有甲基化功能，反应需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰作用的活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶酶蛋白结构3种不同亚基同型二聚体2种不同亚基限制所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM特异性位点或识别序列EcoB：TGA(N)8TGCT回文序列EcoRI：GAATTCEcoP1:AGACC限制性核酸内切酶的命名：1.寄主微生物属名第一个字母（大写，斜体）和种名前两个字母（小写，斜体）如：大肠杆菌Eco2.一种寄主有几个不同的限制-修饰系统，以正体罗马数字表示。HindⅠ、HindⅡ3.前面还应带有系统名称。如限制性内切核酸酶R.HindⅠ修饰酶M.HindⅠ2影响限制性内切核酸酶活性的因素：1.酶的纯度：若存在外切酶污染，会消化掉粘性末端的突出部分，降低其后重组产物的形成2.DNA样品的纯度：内切核酸酶消化DNA的反应速率取决于DNA样品纯度，杂质影响酶切反应活性3.DNA的甲基化程度：甲基转移酶对DNA起修饰作用，使得DNA不受体内限制性内切核酸酶的切割4.酶切反应的温度：大多数最适反应温度为37℃5.DNA分子构型：所需酶量超螺旋结构＞线性结构6.反应缓冲液：多数酶切反应所需pH7.0~7.5，缓冲液防止酶的氧化7.酶的星号活性：为达到限制性内切核酸酶的最佳反应速度和切割专一性，避免在星号活性条件下进行反应DNA分子完全酶切消化和部分酶切消化完全：对DNA上所有的识别位点都被酶切开部分：DNA上只有部分酶切位点被切开当底物DNA分子纯度低、识别序列甲基化、酶用量不足、反应缓冲液和反应温度不适、反应时间不足（虽影响DNA片段得率，但可获得所需DNA片段）DNA连接反应的条件：必须是两条双链DNA；DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）；需要能量（动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+）；需是相邻的DNADNA连接酶作用机理：1.ATP（NAD+)提供激活的AMP；2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi；3.AMP与连接酶的赖氨酸ε-氨基相连；4.AMP随后从连接酶的赖氨酸ε-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物；5.3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP影响连接反应的因素：1.反应温度，最佳为37℃；2.连接酶浓度；3.ATP浓度；4.DNA片段末端DNA聚合酶的分类：1.依赖于DNA的DNA聚合酶；2.依赖于RNA的DNA聚合酶—反转录酶DNA聚合酶1.共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3’-OH端；2.主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：功能：1.一条单链多肽；2.具备5’→3’外切酶活性，位于N端，切除DNA损伤；3.具备3’→5’外切酶活性，校对作用；4.具备5’→3’聚合酶活性，把dNTP一个个加到DNA链上Klenow片段：具有3’→5’外切酶活性及5’→3’聚合酶活性；DNApolⅠ经枯草杆菌蛋白酶酶切，失去5’→3’外切酶活性后的大片段用途：1.3’端补平--补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端；2.DNA3’末端标记--在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP；3.cDNA第二链的形成；4.用于Sanger双脱氧末端终止法进行DNA序列分析；5.在单链模板上延伸寡核苷酸引物，以合成杂交探针和进行体外杂交TaqDNA聚合酶：5’→3’聚合酶活性，5’→3’外切酶活性，无3’→5’外切酶活性，因此无3’→5’校正功能反转录酶AMV：1.来源：RNA肿瘤病毒。普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒2.性质：①α链有反转录活性和RNaseH活性（RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’→3’或3’→5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链）②β链RNA-DNA杂交双链中5’→3’DNA外切酶活性。3.用途：合成cDNA；合成DNA探针；RT-PCR用的模板（克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链）T4DNA聚合酶的性质1.来源：从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。2.酶活性：有聚合酶活性和外切酶活性（降解单链更快）。3.特点：当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使外切酶功能，制造出3’隐蔽端；如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。4.用途：补平隐蔽末端；DNA3’末端标记3T7DNA聚合酶：1.来源：从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的。2.结构：由两个亚基组成：T7基因5编码的大亚基：有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性。3.特点：持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链；3’→5’外切酶活性高：单链和双链都能降解；不受DNA二级结构的影响：其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍4.用途：以大分子量DNA为模板的合成，如M13；进行末端标记，取代合成法标记3’末端，与T4DNA聚合酶相同；补平隐蔽末端，合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高末端转移酶主要用途：1.用于克隆DNA片段；2.用于DNA片段3’端标记；3.按照模板合成多聚核糖核苷同聚物外切核酸酶的作用与内切核酸酶的区别作用：对于双链：将双链DNA转变为单链DNA，从双链DNA分子中移去5’突出末端；对于单链：从PCR产物中去掉引物区别：切割方式不同：核酸外切酶只能从核苷酸一段开始催化水解磷酸二酯键，最终水解产物是单个的核苷酸；而内切酶可以从DNA分子中间水解磷酸二酯键，且具有专一的识别位点载体：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件要求：复制起点：能在受体中复制；筛选标记；限制性内切酶切割位点；载体的大小：原则上要求载体越小越好；适当的拷贝数；载体的安全性：质粒不能随便转移；外源基因的表达：启动子。具备条件：在克隆载体DNA分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子；至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制；至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞；克隆载体必须是安全的。质粒的性质与特点：性质：1.复制：质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；2.质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存；3.质粒的转移性：接合型质粒--能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。非接合型质粒--不能在天然条件下独立地发生接合作用。特点：在宿主细胞内必须能自主复制；必须具备合适的酶切位点，供外源基因插入，同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选，最好有较高的拷贝数，便于载体的制备4凝胶电泳中常用的指示剂和染色剂分别是什么？其作用与区别？指示剂：溴酚兰和二甲苯青及银染色作用：1.增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；2.在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置；3.使样品呈色，使加样操作更方便染色剂：溴化乙锭（EB）染色法，Goldview作用：可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出荧光，用于观察DNAMaker：用于对照，有不同条带作为参照物，找到其他点样的条带大小PCR技术原理、基本过程？原理：在有DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可进行DNA单链5’→3’合成反应。模拟天然DNA复制过程基本过程：1.变性：92~96℃高温处理使模板DNA双链间氢键断裂，一般变性时间为30s2.退火：将温度降到37~72℃，使引物与模板的互补去结合，一般时间为30s3.延伸：在72℃下，DNA聚合酶将dNTPs连续加到引物的3’-OH端，以互补的DNA单链为模板，沿着模板延伸合成模板DNA的互补链PCR反应体系：1.缓冲液：除了提供一定的pH缓冲能力外，还有一些有助于反应进行的成分。Tris-HCl、Mg；2.模板；3.dNTP：是dATP、dGTP、dTTP、dCTP的总称；4.耐热的DNA聚合酶；5.引物：单链的DNA片段；6.PCR反应的最佳条件表达载体的表达方式包括组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达各种单链内切核酸酶的用途：S1核酸酶：切掉DNA片段的单链突出末端；在双链cDNA合成中切除发夹环结构