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1基因工程重要特征：l供体基因转移至受体细胞，改造生物遗传性，创造出新性状。2DNA分子在受体细胞内复制，为大量纯化DNA片段提供了可能。基因工程理论依据(特点)①基因有共同的物质基础：有遗传功能的特定核酸序列：DNA片段或RNA。②基因可切割：存在间隔序列（重叠序列的基因也可切出）。③基因可转移：可在染色体DNA或不同染色体之间跳跃，基因组也可重组。④多肽与基因之间存在对应关系一种多肽对应一种基因。根据表达产物的性质可检查基因的转移或重组。⑤遗传密码通用三联密码子（少数除外）与氨基酸相对应，所有物都相同，只要具备转录翻译条件均能转译出原样的氨基酸。基因可人工合成。⑥基因可复制传递遗传信息重组基因可传代，获得相对稳定的转基因生物。※基因工程基本操作过程分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接目的基因和载体DNA在体外连接转将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养筛选择、筛选含目的基因的克隆表培养、观察目的基因的表达基基因因工工程程技技术术的的意意义义大大规规模模生生产产生生物物分分子子。。设设计计构构建建新新物物种种。。搜搜寻寻、、分分离离和和鉴鉴定定生生物物体体尤尤其其是是人人体体内内的的遗遗传传信信息息资资源源。。限制性核酸内切酶的命名原则①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。I和III类限制修饰酶的基本特征Ⅰ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。Ⅲ型：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。Ⅱ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。Ⅱ限制性核酸内切酶的功能1.识别双链DNA分子中4-6对碱基的特定序列2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。※II型限制性核酸内切酶的3大特点识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列（靶序列）。识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。切割位点的规范性：双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。※星活性产生的原因：(1)高甘油含量(5％,v／v)。(2)限制性内切核酸酶用量过高(100U／ugDNA)。(3)低离子强度(25mmol／L)。(4)高pH(8.0以上)。(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等。(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等。以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。※抑制星号活性的方法：1.尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。2.尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。3.将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。4.将反应缓冲液的pH值降到7.0。5.二价离子用Mg2+。影响限制性核酸内切酶活性的因素①DNA样品的纯度2可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间②DNA样品的甲基化程度③酶切反应的温度④DNA分子结构⑤核酸内切酶的缓冲液Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。※连接酶的主要类型T4DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶（E.Coli）T4DNA连接酶的作用机制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上使其活化，释放出酶。③活化的5’磷酸根与相邻的3’羟基形成3’，5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。※DNA连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基（-OH），另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD＋或ATP）提高平头末端连接效率的方法包括：1.加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。2.加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。3.加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。4.加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200mmol/L。大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶。分子量为76kDa。Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：1.修复由限制性核酸内切酶造成的3’凹端，使之成为平头末端。2.以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记。3.用于催化cDNA第二链的合成。4.用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端标记※反转录酶活性：①DNA聚合酶活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物。反转录酶中不具有3’→5’外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性（5’→3’及3’→5’核酸外切酶活性）：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5’端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNAlibrary)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因方法宿主细胞的限制和修饰作用；1.两种不同来源的入-噬菌体（入-K，入-B）。2.能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B株）。33.当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，（入K-B，入B-K）感染下降数千倍。4.一但入K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入-K后代，能感染B株,不能再感染原来K株.称为：宿主细胞的限制和修饰作用载体（vector）是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、病毒载体、人工染色体载体等。按功能:克隆载体和表达载体、测序载体、穿梭载体。表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。载体的功能1.载体的本质是DNA复制子，为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2.为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。3.为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。载体应具备的条件1.具有对受体细胞的可转移性或亲和性。2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。4.具有合适的筛选标记。5.分子量小，拷贝数多。6.具有较小的分子量。7.具有较高的遗传稳定性。8.具有安全性。克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上随着染色体DNA的复制而同步复制。②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。③载体都具有合适的遗传标记基因。④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。质粒克隆载体构建原则过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子2、正确获得构建质粒克隆载体的元件3、组装合适的选择标记基因4、选用合适的启动子5、构建过程力求简单标记基因按其用途分为2类：选择标记基因:用于鉴别目的载体的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。筛选标记基因:用于区别重组质粒与非重组质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒挑选出来。质粒载体的不稳定性1、质粒稳定遗传必须的两个条件：每个世代、每个质粒至少要复制一次在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中2、质粒分配方式有主动分配和随机分配两种假说。主动分配：天然质粒：具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par）能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中随机分配：人工质粒：人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。一般情况下也能保证质粒的稳定遗传，但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。3、分离的不稳定性没有获得质粒拷贝的细胞，最终繁殖成无质粒的优势群体。4、结构的不稳定性寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。5、影响质粒载体稳定性的主要因素新陈代谢负荷1）复制负荷2）转录和翻译负荷使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。减缓的程度与质粒的分子量成正比。丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！质粒克隆载体的用途用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。构建基因组文库和cDNA文库。可用于目的基因的测序。作为核酸杂交时探针的来源。λ-DNA载体的构建：4构建依据λ噬菌体是一种温和噬菌体能承载较大的外源DNA片段：λ-DNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kbλ-DNA可缺失（生长非必需）在λ-DNA上有多种限制性内切酶位点构建的基本策略与技术路线策略:切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。λ-DNA作为载体的优点λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。重组λ-DNA分子的筛选较为方便。重