搜索
大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测（基因工程实验报告）程庆佳（云南大学，生命科学学院，生物技术，20091070004）（班级：周二下午实验班;组号:第八组;老师：赖建华；同组员：顾聚）摘要：此次实验的目的是对大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测，其中的关键步骤包括了大肠杆菌基因DNA的提取，PCR扩增，DNA体外重组，感受态细胞的制备，重组DNA的转化，重组转化的检测等多种具有紧密连接性的实验，使学生可以掌握一套具有连贯性的实验过程，帮助学生塑造连贯试验的观念，从而得到更好地成长与进步。关键词：提取、扩增、重组、感受态细胞、转化、检测正文：此次实验的最终目的是要使学生连贯性的掌握本学期的实验，所以要求我们要熟悉每个实验的原理过程，以及实验结果的准确分析，只有这样才能保证实验最终结果的准确性，才能真正地掌握此次实验。1、大肠杆菌基因组DNA的提取原理：DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。简要步骤：（1）、菌种活化：将菌落接种于LB培养基中，37度培养过夜（2）、取1ml菌液转入1.5ml离心管中，5000rpm离心1分钟，去上清。（3）、加入500ulTE，50ul10%SDS，5ul蛋白酶K，混匀，55度，保温20min（4）、加入50ul，5MNacl混匀，再加入50ulCTAB提取液，混匀，65度，20min（5）、去蛋白：300ul的酚和氯仿，轻轻混匀，10000rpm，2min（6）、上清转入另一个干净的1.5ml离心管，加入等体积氯仿异戊醇，轻轻混匀，10000rpm，2min，上清转入干净的1.5ml离心管中（7）、加入1/10体积的醋酸钠，2倍体积的无水乙醇轻轻旋转小试管，可见絮状沉淀，即为染色体丝，10000qpm，3min收集沉淀（8）、弃上清，沉淀用500ul75%乙醇洗涤两次（每次10000rpm离心1min）（9）、室温下稍干，加适量（约50ul）RTE溶解，37度30min（10）、电泳观察结果12如图所示，1号为本组实验结果。对比maker,第一条带为正常大肠杆菌基因组，中间可以看见模糊的条带，可能为断裂的基因组片段，下面最亮的为RNA。出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈。本组电泳带还比较清晰整齐，其他组不整齐的带可能是电泳技术问题。RNA含量很大，所以显示比较清晰。在电泳过程中应注意的是胶浓度要与DNA分子量呈线性关系，所以胶浓度对于实验结果检测的成败有重要的意义。另外，在实验过程中应避免用力，以此来保障DNA样品结构的完整性与稳定性。2、PCR扩增目的基因核糖核苷酸酶HII基因原理：聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点。PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。简要步骤：（1）、在PCR管中加入所需试剂和样品。（2）、将PCR管放入事先调好的PCR仪中，进行PCR（3）、PCR后，对样品进行电泳检测结果。如图所示，对比第一个条带maker，右边的条带可以看到PCR进行的较为成功，DNA条带下并无明显的其他条带，所以DNA的纯度较高，并无杂质RNA与蛋白。由样品对比的明暗度可以看出，较为明亮的DNA含量较多，反之一样。此次实验主要要求学生掌握PCR反应仪的使用方法以及电泳反应条带的正确分析，从而得到正确的实验结果。3、PMD-RNaseHIIDNA体外重组原理：DNA重组是指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。DNA体外重组技术是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子和外源DNA分子进行连。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性开端的DNA分子连接在一起，而且能使平端的双链DNA分子连接在一起，但平端连接的热效率要比粘性末端连接效率低。连接反应温度在37度时利于连接酶的活性，但在此温度下，粘性末端的氢键结合不稳定。一般的连接条件是12-16度，反应12-16小时，这样既可最大限度的发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。连接产物转化宿主细胞后，还需对转化菌进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。简要步骤：（1）、10%琼脂凝胶电泳，用6孔梳子做胶，将扩增剩余产物全部上样电泳。（2）、切胶，回收。加入400ul溶胶液BindingBuffer，55度溶胶（3）、装柱：将溶解好的溶液加入回收柱中，并将回收柱套入2ml废液管中。（4）、12000rpm离心30秒，去除废液。（5）、漂洗：将500ul漂洗液washsolution加入回收柱中，并将回收柱重新套入2ml的废液管中，12000rpm离心30秒，去除废液（6）、重复漂洗一次去除废液。（7）、12000rpm离心2min，将回收柱套入纯净无菌的1.5ml离心管（8）、向回收柱的正中央加20ul洗脱buffer，50度放置15分钟（9）、12000rpm离心2分钟，1.5ml离心管底部的溶液即为回收的DNA4123此电泳图是PCR产物回收检测的电泳图，是为了检测两种试验样品是否可以继续使用，由图中可以看到1号为对照条带，2、3两个样品的条带较为清晰，所以可以使用，并且4号为重复样品。之后进行2、3两种样品的切胶回收。123此图中1号为对照条带maker，2、3号为切胶回收样品，样品中没有杂质，样品条带较为模糊，表明回收的样品含量较少，但是还可以勉强使用。最后在小离心管中加入5ul胶回收的PCR产物，再加5ulsolutionI连接反应液，加0.5ul的pmd18-TVectorDNA，混匀后，于16度反应30分钟以上即为重组子。此次试验要求我们掌握切胶的过程，亲自动手进行实践，还使我们熟悉了重组子构建的步骤与过程，熟悉DNA体外重组。4、大肠杆菌感受态细胞制备原理：本次试验采用CaCl2制备大肠杆菌的感受态细胞。所谓的感受态，是指受体最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。Ca也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或—70度保存。简要步骤：（1）、取冻存宿主菌一环，接于LB无抗平板培养基上，37度培养过夜（2）、取培养菌液1.5ml转入1.5ml离心管中，在冰上冷却10min，于4度，4000rpm离心5分钟（3）、倒净上清培养液，用750ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10min（4）、4度，4000rpm离心5分钟（5）、弃上清，加入500ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞。冰浴10min，4度，4000rpm离心5分钟（6）、弃上清，加入50ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，放在冰上片刻后，即制成了感受态细胞悬液；冻存。本次试验较为简单，主要是进行重复的CaCl2溶液的添加，之后离心处理，其中的关键在于冰浴温度的控制以及无菌的操作条件，所以操作要快速并且保障准确性，还要准确计量时间。感受态细胞转化效率的影响因素（1）细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。（2）质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10--100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。（3）试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。（4）防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。（5）整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。本次实验要求我们要掌握感受态细胞的制备程序，以及应注意的几个实验关键点，可以参考上面的五点注意事项，来严格的控制实验的操作过程，从而得到完好的感受态细胞，来进行后面的实验。5、重组PMD-RNase