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基因工程实验手册1目录实验一、质粒DNA的提取实验二、细菌基因组的提取实验三DNA的限制性内切酶解及电泳实验四、PCR基因扩增及电泳实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化基因工程实验手册2实验一、质粒DNA的提取质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子,是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。在基因克隆的实验中,要把一个有用的外源基因通过重组DNA技术,送进生物细胞中去繁殖和表达。实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体,细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。作为基因工程的载体需具备下列条件:（1）是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3)载体DNA链上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择的遗传标记,如抗氨苄青霉素基因(AmpR,抗新霉素基因(NeoR)等,以此判断载体是否进入受体细胞,并据此将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来.细菌质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制型和松驰控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,与染色体复制相关联,每个细胞只含有一个或几个质粒分子,如ColEI质粒(含有产生大肠杆菌毒素EI基因),pBR322就是ColEI衍生的质粒。后者在整个细胞周期中随时可以复制,具多拷贝,一般在120个以上。本实验分离纯化的质粒为pQE30,为高拷贝质粒。通过本实验学习了解质粒DNA的特点,掌握碱性SDS快速法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA.一、实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤:①细菌培养物的生长;②细菌的收获和裂解;③质粒DNA的纯化。本实验以碱性SDS快速法小量制备pQE30质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是,加溶菌酶可破坏菌体细胞壁(小量制备可省略不用溶菌酶),去污剂SDS可使细胞壁裂解,并使蛋白质变性,在碱性条件下,破坏碱基配对,故可使宿主的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时(加入酸性试剂中和),质粒DNA链迅速得到准确配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中,乙醇沉淀后可得到基因工程实验手册3质粒DNA.如需进一步纯化,可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型:当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共价闭合环状DNA(CCCDNA),这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型;如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构,另一条出现有一至数个缺口时,称之为开环DNA(OCDNA),此即OC构型;若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后,发生双链断裂而形成线性分子(LDNA),通称L构型。质粒DNAMr一般在106～107之间,常以kb表示(lkb双链DNA=6.6×105),如质粒pUC19的Mr为1.8×106(2.69kb)。在琼脂糖凝胶电泳中,不同构型的同一种质粒DNA,尽管M相同,仍具有不同的电泳迁移率,其中走在最前沿的是scDNA,其后依次为LDNA和ocDNA。二仪器、材料与试剂(一)仪器1.恒温培养箱2.恒温摇床3.台式离心机4.高压灭菌锅(二)材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇基因工程实验手册410.RNA酶11.氨苄青霉素12.蔗糖13.溴酚蓝14.酚15.8一羟基喹琳16.β一巯基乙醇17.盐酸(HCl)18.含pUC19质粒的大肠杆菌19.吸头、小指管(三)试剂1.溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCL(pH8.0)10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合3.溶液III5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL4.TE缓冲液l0mmol/LTris-HCI1mmol/LEDTA(pH8.0)570%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.、膜RNA酶将RNA酶溶于10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。基因工程实验手册57.终止液:40%蔗糖、0.25%溴酚兰8.酚。三实验步骤1.将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中,接入上述的含pQE30质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。2.取1.5mL培养物倒入微量离心管中10000r/min离心2min.3.吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀室温放置10min。5.加200μL溶液II(新鲜配制)，盖紧管口，混匀内容物，将离心管放冰上5min。6.加入150μL溶液III(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上15min。7.12000r/min离心15min将上清转移到另一离心管中。8.向上清中加人等体积酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后室温放置5～10min.12000r/min，离心5min.倒去上清液,把离合管倒扣在吸水纸上,吸干液体。10.加入20μTE缓冲液,使DNA完全溶解,-4℃保存。四实验安排本实验一天内可做完。实验结果可结合下一个实验一起观察。五、讨论1.细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。如果寄主细胞没有完全裂解,就会显著降低质粒DNA的回收率。理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出,而又没有污染过多的染色体分子。2.提取过程中,除规定的实验条件外,应尽量保持低温,避免过酸过碱,操作中手法要温和,防止机械剪切,尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。基因工程实验手册63.采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。一般来讲,要将蛋白质尽量除干净,需多次抽提,本实验虽只抽提一次,已能达到实验要求。注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。4.乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法,通常采用冷乙醇(无水乙醇贮于-20℃),沉淀条件为-20℃、1h。因本实验为微量快速,室温下数分钟DNA即可沉淀,虽然DNA量少,但纯度相对高(因为低温长时间杂质也一并沉淀下来),有利于以后的酶切及电泳结果。沉淀方法也可用异丙醇,只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来,这对于大体积的质粒DNA沉淀十分有效。但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来,因此需要用70%乙醇很好地洗涤。一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。基因工程实验手册7实验三DNA的限制性内切酶解及电泳（参考酶使用说明书）一、实验原理DNA的限制性内切酶酶切技术是分子克隆和基因操作中最为基本和重要的方法之一。限制性核酸内切酶,简称限制性内切酶、限制酶或内切酶,是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,主要存在于原核细胞中。限制性内切酶有I、Ⅱ、Ⅲ、三类,其中第II类酶在分子克隆和基因操作中最为有用,是常用的分子生物学工具酶,其基本特性如下:专一性地识别并切割特定的核苷酸序列,例如:EcoRI酶的识别与切割序列为:5'……GAATTC……3'3'……CTTAAG……5'2.识别的核苷酸数目多为4～6bp长度范围,少数酶能识别更长的碱基序列,如8～13bp。3.识别序列大多数为二重对称,或称为回文序列。少数酶酶切后产生带平末端的DNA片段,如HpaII、AluI和PvuII等,但大多数酶切割产生的片段具有凸出的粘性末端,如EcoRI酶切后产生5F-P粘性末端,而PstI则产生3'-OH粘性末端。4.有的不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列,甚至切割位点也相同,这些酶称为同裂酶或异源同工酶,例如HpaII和MspI。有的限制性内切酶识别位点不同,但对DNA切割后能产生相同的粘性末端,这些酶称为同尾酶,如BamHI、BglII、MboI、XhoII等。5.限制性内切酶一般都以镁离子为唯一的辅助因子,并要求有一定的盐离子浓度、酸碱度和温度条件。限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同,可采用单酶切、双酶切和部分酶切等不同的方法。根据酶切反应的体积不同,又可分为小量酶切反应和大量酶切反应等。一般情况下,小量酶切反应用于质粒等的酶切鉴定,体积为20μL,大量酶切反应用于制备目的基因片段,体积为50～100μL。本实验安排的是EcoRI对质粒DNA的小量酶切、HindⅢ和SalI对质粒DNA的双酶切以及Sau3AI对真核细胞基因组DNA的部分酶切。二仪器、材料与试剂(一)仪器高速离心机,冷冻离心机,水浴锅,稳压电泳仪,电泳槽,手提式紫外检测仪,紫外检测仪,EP管,吸嘴,微量进样器,烧杯,量筒,塑料手套,慑子,剪刀,三角瓶。(二)试剂(1)EcoRI限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(2)HindIII限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(3)NruI限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(4)Sau3AI限制性内切酶(附10×酶切缓冲液)。(5)λDNA的HindIII酶切样品,作为相对分子质量标准。(6)无菌水:量取50mL重蒸水于100mL三角瓶中,1.034×105Pa灭菌20mino分装于几只灭菌过的EP管中,贮存-20℃备用。基因工程实验手册8(7)0.2%溴酚蓝、50%蔗糖上样缓冲液。(8)1mg/mL溴化乙锭溶液。(9)电泳缓冲液。(10)琼脂糖。(三)材料纯化的PCMV-M质粒DNA。三实验步骤(参考酶使用说明书)(一)PCMV-M质粒DNA的EcoRI小量酶解1.在无菌Ep管中用微量进样器依次加入下列试剂无菌水7μLEcoRI10×缓冲液2μLPBR322质粒DNA10μL(含0.2～1μgDNA)EcoRI限制性内切酶1μL(5U/μL)总体积20.μL2.离心2s,收集并混匀反应液。3.37℃水浴1.5～2h。4.取出Ep管,吸取1～2μL进行电泳分析,以λDNAHindIII酶切标准相对分子质量为对照，电泳鉴定DNA酶解效果。如酶解不完全,可继续37℃水浴,或加入适量限制性内切酶后继续反应。5.经电泳观察酶切反应完全后,将上述反应液置65℃水浴中10～15min,中止酶切反应,保存于一20℃备用。(二)HindIII和SalI对pBR322质粒DNA的双酶切1.在无菌Ep管中周微量进样器依次加入下列试剂无菌水15μLHindIII10×缓冲液2μL质粒DNA2μL(含1～2μgDNA)HindIII限制性内切酶1μL(5U/μL)总体积20μL2.离心2s,收集并混匀反应液。37℃水浴1h。3.加入1μL1molANaCl,稍加混匀后再加入1μL&门限制性内切酶.4.离心2s,收集并混匀反应液。37℃水浴1h.5.以λDNAHindIII酶切标准相对分子质量为对照,电泳分析鉴定DNA酶解效果。(三)限制性内切酶的部分酶解1.在0.5mLEP管中,建立以下混合体系进行基因组DNA酶解:10×Sau3AI缓冲液5μL提取的基因组DNA20μL(25～60μg)无菌重蒸水75μL总计100μL2.将上述混合物于55℃水浴15min,充分分散基因组DNA片段。3.将反应混合物分装于5支Ep管中,其中管1为30μL,管2～管4各为20μL,管5为10μL。冰浴放基因工程实验手册9置。4.按3～10U/μgDNA的量加入Sαu3AI于管1,轻弹管壁混匀,短暂离心2S收集反应物,冰上放置。5.从管1中吸取