基因工程常见问题梳理

基因工程常见问题梳理1、什么是星星活性，产生的原因及解决方案？星星活性是指在极端非标准条件下，限制性内切酶能切割与识别序列相似的序列，而造成误切的现象。产生的原因：1)甘油浓度过高，大于5%；2)酶过量，100U/ul；3)Mg2+被其他的二价金属离子取代；4)pH过高，8.0；5)添加了有机溶剂DMSO、乙醇等；6)离子强度低，25mmol/l。2、限制性内切酶的发现、分类和各类的特点：限制性内切酶的发现是20世纪60年代，噬菌体侵染大肠杆菌之后，DNA在感染宿主中会被降解，从而提出了限制酶切和限制酶的概念。1970年，H.Smith偶然发现了HindIII，揭开了限制酶的面纱。主要分为三类：I类、III类：限制作用需要ATPII类：最常使用的一类限制酶，识别序列主要有4-6个核苷酸，回文结构，与甲基化的反应分开，限制作用不需要ATP。3、不同条件的两种限制性内切酶，双酶切时应该采取什么措施？1)同步双酶切：配置同时适合这两种限制酶的最佳缓冲体系，同时加入两种酶；2)分步酶切：分开加酶时遵循先低盐后高盐原则，而且可以在加入第二种酶的时候使第一种酶失活，避免产生星星活性。3)使用配有特殊缓冲液的酶进行酶切：在大多数情况下采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切，这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切时，反应速度会减慢，因此需要增加酶量，延长反应时间。4、差异杂交的基本原理和思路差异杂交要拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中的目的基因正常表达，在另一个细胞群体中的目的基因不表达。在这种情况下便可制备两种不同的mRNA提取物。其一是含有目的基因的mRNA的总mRNA，另外一种是不含有目的基因mRNA的总mRNA。因此，可以通过这两种mRNA的cDNA拷贝为探针，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。思路：将来自一种细胞的mRNA反转录形成cDNA的第一链，用这种细胞的cDNA与另一种细胞过量表达的mRNA进行杂交。如果在第一种细胞中是特异表达的mRNA，则会产生特异的cDNA链，不会与第二种细胞的mRNA杂交。通过羟基磷灰石柱层析，洗脱未形成杂交体的cDNA，它代表第一种细胞中特异表达的基因。以该链为探针，第一种细胞的cDNA文库的重复拷贝杂交，跟探针能够杂交克隆的是在组织细胞中特异表达的mRNA。再对这样的克隆进行测序比较，鉴定，就分离得到这种组织特异表达的基因，所有包含重组体的菌落，阳性反应在X射线上呈现黑色的点。比较这两种底片对照原平板。便可以挑选所有含有目的基因的菌落，供进一步研究使用。5、如何检测外源基因1)外源基因导入基因组中的检测：southern杂交、PCR扩增检测、报告基因检测；2)外源基因在基因组中转录检测：northern杂交；3)外源基因在基因组中翻译检测：western杂交；4)筛选标记基因：如一些抗性基因表达后可在含抗生素的培养基上存活；5)直接观察基因表达的特殊性状来检测目的基因是否表达。6、目的基因重组后不表达的原因。1)导入了特异启动子对该基因的表达无效；2)启动子与目的基因的距离过长，表达效果降低；3)由于密码子偏爱性，目的基因含有大量寄主细胞的稀有密码子而造成表达量降低4)真核基因在原核表达系统中的表达方式不一致；5)寄主细胞中内源蛋白造成外源蛋白降解，或因为修饰系统不同而使外源蛋白活性降低或缺失。7、蓝白斑筛选的原理：某些质粒带有大肠杆菌lacZ突变体lacZ’基因，当其与另一个lacZ突变体lacZΔM连接时可实现α-互补，编码β-半乳糖苷酶。如果在lacZ’基因的上游插入一段小的DNA片段（如51bp的多克隆位点）则不影响其功能互补。但是再在该DNA片段上插入一段DNA片段，将使得其失去功能互补的特性，无法编码β-半乳糖苷酶。非重组体可以在IPTG的诱导下生成β-半乳糖苷酶，作用于X-gal，生成蓝色的菌斑。重组体则不能产生β-半乳糖苷酶，生成白色的菌斑。因此可以通过观察菌斑的颜色来快速鉴别重组体与非重组体。相应的受体菌有JM系列、TG1、XL1-Blue；pUC系列的载体与外源基因的形成的重组体可以进蓝白斑筛选。8、IPTG诱导的原理：IPTG是一种乳糖衍生物，在体外进行乳糖操纵子的研究时，并不直接使用乳糖作为诱导物，而是使用其衍生物IPTG作为诱导物。IPTG可以与阻遏蛋白结合，使得其不能与lac操纵子结合，使得RNA聚合酶可以与操纵子结合，调控结构基因的表达，产生β-半乳糖苷酶。当无诱导物的时候，则阻遏蛋白与操纵子结合，抑制RNA聚合酶与lac操纵子结合，则结构基因不表达。9、蓝白斑筛选假阳性形成的原因1)插入的小片段不是目的片段；2)携带lacZΔM的质粒插入到了lacZ’基因的内部不形成α-互补；3)β-半乳糖苷酶N端的α肽被修饰，失去了原有的活性；4)插入的外源片段引起α肽的可读框的改变或者插入的片段在正确的可读框中含有终止密码子；5)IPTG和X-gal在平板上未涂布均匀。10、PCR引物设计引入酶切位点时，为什么要在酶切位点后加上一些碱基？作为保护碱基，保护PCR引物不被酶降解；为限制酶酶切提供支点，提高酶切效率。11、PCR的基本原理，试剂，预先必须知道的信息？PCR是利用DNA半保留复制的原理在体外以模板DNA、引物和四种dNTP的存在下，依赖于DNA聚合酶，按5’-3’反向合成双链DNA的多聚核苷酸酶促反应。主要有三个程序：95℃，变性；50-60℃，退火；72℃，延伸，1kb/min。试剂：DNA模板、上下游引物、含Mg2+的buffer、4种dNTP、DNA聚合酶（Taq）预先应该知道模板和配对的引物。12、非特异性产物形成的原因：1)引物的退火温度过低，适当提高退火温度或采用二温度点法；2)引物的长度过短，特异性差，一般应在18-30bp；3)引物设计的时候具有二聚体结构，导致形成非特异性产物；4)循环次数增加，提高了非特异性产物的浓度，一般在35个循环足够；5)Mg2+浓度过高，导致产物出错率提高；6)模板浓度低，引物浓度过高，引物自身结合；7)酶量过多；8)可能是电泳体系存在问题。13、质粒的特性：1)不相容性：两个质粒在同一宿主细胞中不相容；2)转移性：可以通过结合作用转移到细菌中，便于转化；3)自主复制性：可以在宿主中自主复制；4)标记基因：便于筛选；5)拷贝数：具有一定的拷贝数，便于载体的制备。严谨型质粒具有低拷贝数，一般为1-几个拷贝；松弛型质粒具有高拷贝数，一般可达到几百拷贝。14、质粒的重要组成元件：1)复制原点（ori）：保证在宿主中能自主复制；2)MCS：使得有合适的酶切位点与目的片段相连；3)标记基因：便于筛选。4)用于表达的质粒载体还具有：5)启动子：调控目的基因的转录和表达；6)终止子：终止目的基因的转录和表达；7)其他调控元件：增强子8)Taq基因：检测、分离纯化目的基因产物15、载体的特征：载体可以是改造后的质粒，也可以是动植物病毒的DNA。1)转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性；2)复制位点或整合位点：为外源基因提供复制能力和整合能力；3)具有较高的DNA装载能力；4)具有MCS，为外源基因提供酶切位点；5)具有特殊标记的筛选基因。载体可分为表达载体和克隆载体，表达载体是在克隆载体的基础上增加了一些调控表达的元件，如启动子、终止子、增强子、剪切信号、融合基因等16、受体细胞的特点：1)易于制备成感受态细胞，便于重组体的转入，并能在其中稳定存在；2)安全，无致病性；3)最好无密码子偏爱性；4)具有与重组体相似的表达方式；5)具有转录和翻译后修饰系统，有利于外源基因的表达；6)内源蛋白含量低或无，防止外源蛋白被酶降解，促进外源蛋白的高效分泌表达；7)有限制性缺陷型，如营养缺陷型，容易筛选；8)具有较高的遗传稳定性，容易培养；9)具有较高的理论和实践生产意义常用的受体菌：具有蓝白斑筛选特性：JM系列、TG1、XL1-Blue、DH5a含有能表达T7噬菌体的RNA聚合酶的表达细胞：BL21(DE3)17、cDNA文库与基因组文库：cDNA文库是指以生物体的总mRNA为模板，逆转录成cDNA，与合适的载体连接转入到宿主细胞中，经过筛选得到的阳性克隆菌落。基因组文库是指将生物体全部基因组DNA片段通过限制性酶酶切成一段段小的DNA片段，与载体连接，进行重组转化培养，得到的阳性克隆菌落。CDNA文库含有全部的编码基因，基因组文库含有所有的基因。18、杂交技术：1)Southern杂交：DNA与DNA杂交。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性酶切的DNA片段，将胶上的DNA变性（NaOH可使双链DNA变性为单链），并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其它固相支持物上，经干烤或紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测DNA分子。2)Northern杂交：以DNA为探针，检测RNA。将提取的总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将它们原位转移到固定膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交，然后通过探针的标记性质检测杂交体的实验技术。3)Western杂交：抗原-抗体杂交，将已用PAGE或其它凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，类似southern杂交。第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗（同位素或非同位素的酶）来检测蛋白质。19、影响杂交的因素1)核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复制性速度越快。探针长度一般控制在50-300个碱基为好；2)温度：温度过高不利于复性，温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，最佳温度应该较TM值低25度；3)离子强度：低离子强度，核酸杂交缓慢，随着离子强度增加，杂交反应率增加。高离子强度有利于维持杂交体的稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。4)杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸的TM值，使探针在低温下更稳定，能更好地保留非共价结合的核酸。5)核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同核酸的总长度，两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性。20、基因工程及相关支撑技术、常用的酶：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术（基因重组、克隆和表达等重组DNA技术）和下游技术（基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程）具体支撑技术：核酸分子杂交技术（southern杂交、northern杂交、western杂交）、PCR技术、凝胶电泳技术、细菌转化转染技术、DNA序列分析技术、寡核苷酸合成技术、基因定点突变技术。常用的酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、核酸修饰酶21、转基因动、植物的设计：1)目的基因的获得：获取目的片段进行PCR扩增后选择合适的限制酶进行酶切；2)构建重组子：选择合适的载体与目的片段连接形成重组子；3)转化：有原生质体介导法、根癌农杆菌介导法、基因枪法等，植物细胞中常用根癌农杆菌介导法转入外植体，动物细胞应选择全能细胞，如生殖细胞或胚胎干细胞；4)培养：培养转化的愈伤组织或受精卵，得到转基因植物/动物；5)检测转基因动植物是否有目的基因的表达，如产生抗性蛋白。22、目前常用的转基因方法：1)原生质体介导法：使用PEG介导或电击法，将重组体导入原生质体中实现外源基因的转化；2)基因枪法：将外源基因包裹在金属颗粒中，在高压的作用下将金属颗粒导入宿主细胞中，并使外源基因整合到宿主基因组进行表达；3)根癌农杆菌介导法：直接通过细菌的侵染作用将外源DNA整合到宿主DNA中；4)显微注射法：将外源DNA在显微操作系统的辅助下直接整合到宿主细胞核中，无需载体；5)Ca2+处理受体细胞，促进受体细胞自主吸收外源DNA23、感受态细胞的制备：化学法Ca2+处