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基因工程第一章绪论1、基因工程的含义：按照人们的意愿，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。2、基因工程的优点：①打破物种间基因交流的隔离界限；②克服常规育种的周期长，效率低的缺点，定向改造生物性状；③可按照人的意愿去改造物种。3、基因工程理论依据：①不同基因具有相同的物质基础；②基因是可分割的；③基因是可以转移的；④多肽与基因之间存在对应关系；⑤遗传密码是通用的；⑥基因可以通过复制传递给下一代。注：基因工程及其应用的图解看看第二章DNA重组的相关技术及原理1、重组DNA技术的原理重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序2、碱性SDS法提取质粒DNA原理：强碱使所有DNA变性沉淀，而pH为中性时，质粒DNA复性快，形成闭合环状从沉淀物中分离。3、提取DNA总的原则①保证核酸一级结构的完整性；②其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；④其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。4、核酸鉴定①浓度鉴定②纯度鉴定③完整性鉴定5、限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。6、限制性内切酶的命名①用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）Eco流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）Hin②用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoR）。③如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制性内切酶，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。属名种名株名HaemophilusinfluenzaeD嗜血流感杆菌D株HindIIIEcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)7、限制性核酸内切酶的作用机制以环状和线形的双链DNA为底物，在适合的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3’－OH基团和5’－P基团的片段。8、同裂酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。9、同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等10、酶活性单位（U)：在最适反应条件下，一个DNA分子上含有一个酶切位点，60min内切割1gλDNA所需的酶量称为一个单位。11、星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的识别位点专一性和切割效率，称为星号（*）活性。12、基因工程的其他酶（1）DNA连接酶:DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5’-磷酸和3’-羟基生成磷酸二酯键。;（2）DNA聚合酶（Klenowfragment）性质①5’3’聚合酶活性。②3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）用途①3’端补平②DNA的3’末端标记，在3’隐蔽端加上标记的dNTP。③cDNA第二链的合成④双脱氧末端终止法测定DNA序列（3）核酸酶S1催化反应类型:ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区13、聚合酶链式反应PCR:PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。14、PCR技术的原理（1）DNA模板变性（2）DNA模板与引物复性（3）DNA链的延伸15、PCR的过程第一步预变性（pre-denature）90-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。第二步变性（denature）双链完全变性成单链第三步复性（anneal）37-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓度高②引物的链短。第四步延伸（extend）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。第五步变性进入循环重复94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。16、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件（1）TaqDNA聚合酶（2）引物（primer)（4）模板（template)（5）dNTPs（6）Mg2+的浓度17、PCR的特点（1）特异性强（2）敏感性高（3）快速（4）简便（5）可以扩增mRNA18、电泳的基本原理DNA在中性或偏碱性的缓冲液中带负电，在电泳过程中处于凝胶靠负极端的DNA通过凝胶分子筛向正极端移动。19、电泳迁移率：与DNA分子的构型和大小有关与DNA分子中的碱基组成和顺序无关DNA分子的构象（型）：Ⅰ型：超螺旋环状Ⅱ型：带切口环状Ⅲ型：线状相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快；线性分子次之；伸展开环状最慢20、影响连接反应的因素（1）插入片段与载体的浓度比例（10~20倍增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。）（2）反应温度（一般14~16℃）（3）反应缓冲液第三章基因的克隆载体1、载体：在基因工程操作中，携带目的基因、实现目的基因进入受体细胞,并在其中得以无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。2、按功能划分：①克隆载体(cloningvector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体。②表达载体（expressionvector）:使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。3、基因克隆载体的必备条件：①多克隆位点；②能自我复制,有一个复制起点；③选择性标记；④安全。4、标记基因的作用：①指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞；②指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。这种指示也可以是选择性的，也可以是非选择性的，绝大多数为后者。5、质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。6、质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA)；②开环DNA（ocDNA）；③线形DNA（lDNA）7、质粒空间构型与电泳速率:scDNA最快、LDNA次之、ocDNA最慢。8、质粒的不亲和性（不相容性）：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不亲和性或不相容性，这两种质粒称为不亲和性质粒，组成不亲和性群；而彼此能够共存于一个细胞中称为亲和性质粒，亲和质粒则属于不同的不亲和群。9、天然质粒的局限性：①分子量大，拷贝数低；②筛选标记不理想；③单一酶切位点少或无。10、质粒载体的构建策略：①提高质粒载体的拷贝数；②引入多克隆位点MCS；③引入抗性标记基因；④克隆载体DNA分子应尽可能小；⑤在克隆载体中组装“元件”。10、筛选重组子的示意图——重点11、互补：蓝白斑选择原理：①X-gal；②-半乳糖苷酶的显色反应；③lacZ的互补。12、穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。13、Ti质粒载体：存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒。14、Ti质粒作为载体的可能性：①能够自发地整合到植物的染色体上；②能转化多种植物；③强启动子——T-DNA的opine合成酶基因上游有一个强启动子，能启动外源基因的表达。15、天然Ti质粒作载体的缺点：①分子量太大（200kb）；②限制性酶切位点太多。③被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。④在大肠杆菌中不能复制。16、Ti质粒的改造：①保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。②减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。③取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。④冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。⑤加入大肠杆菌的ori和选择标记。⑥加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。17、Ti载体的类型：①共整合载体——需要同源重组才能插入外源基因；②双元载体—既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。18、cos位点：DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。19、天然噬菌体作为载体的局限性：①噬菌体的非必需区太长；②非必需区段上常用的单一限制酶切点少；③选择标记基因少；④载体的安全性20、噬菌体载体的构建：构建策略：①删除噬菌体的非必需区，在这个非必需区内制造限制酶切点，删除DNA必需区段上常用的限制酶切点；②在非必需区引进选择标记基因。③建立DNA重组分子体外包装系统21、cosmid载体（粘粒）：一类由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cossite—carryingvectors。22、酵母人工染色体：①YAC的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。（3）构建原理，按染色体结构构建。②YAC的组成结构：（1）着丝粒区（Cen）；（2）端粒（Tel）；（3）复制起点（Ori）；（4）克隆位点；（5）在酵母中的标记基因；（6）在细菌中操作；第四章目的基因的制备1、基因组文库：将某种生物整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和无性扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，也称为基因文库。2、基因组文库构建的一般步骤：①基因组DNA片段的制备；②载体的准备——相应的酶切，脱磷酸化等处理阻止载体自连；③载体与基因组DNA片段的连接——粘性末端直接连接；人工接头法；同聚物加尾；④转化细胞和克隆选择。3、cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库（cDNAlibrary)，也称基因文库（genelibrary)。4、cDNA文库的特点：①以mRNA为材料，是RNA病毒进行基因克隆的唯一途径。②不含内含子序列，可以在细菌中直接表达。③克隆数比DNA文库小的多，容易筛选。④常来自结构基因，包含了所有编码蛋白质的基因，筛选的假阳性率低。⑤结构基因的表达具有器官、代谢阶段特异性，由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。⑥在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，表现不均匀性。5、不对称PCR（asymmetricPCR)目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是50:1或100:1,关键是限制性引物的绝对量。6、差别杂交：需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针平行杂交，对有表达目的基因的总mRNA反转录构建的cDNA文库进行筛选。7、差别杂交的局限性：①杂交灵敏度低，对于低丰度的mRNA尤为明显；②工作量大，需大量的杂交滤膜和鉴定大量的噬菌斑；③重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。8、消减杂交：原理：通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建消减文库的方式来分离目的基因。有mRNA消减杂交和基因组消减杂交。前者适合分析两样本中差异表达的基因，后者适合克隆两样本特异性存在的基因。9、mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）：用3’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3’-端锚定引物和5’-端