基因工程抗体gaobo141016.

1INSTITUTEFORIMMUNOBIOLOGYDEPARTMENTOFIMMUNOLOGYBoGao,Ph.D.Email:[e-mail]:542371542013-9-3021888年Roux/Yersin白喉外毒素1890年Behring/Kitasato抗毒素；血清疗法1939年Tiselius/Kabatg-globulin1959年PorterFab、Fc1962年EdelmanH、L1962年PorterFab(H+L)、Fc(H)1975年Kohler/MilsteinMcAb1980年TonegawaAbdiversity1984年SharonEngineeringantibody1989年Winter/LernerAntibodyLibraries3EmilvonBehring,1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,productionofantibodyNobelPrizewinners4567抗体占所有生物技术药品的25%2010年440亿美元2015年将超过980亿美元2011年TOP50的生物药物14个是抗体药物，前六位均是抗体药物抗体相关信息8910111213141516抗体的发展抗血清的制备：19世纪末，Behring单克隆抗体：1975，Koehler和MilsteinNature1975Aug7;256(5517):495-7Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.基因工程抗体：1984，SharonNature1984May24-30;309(5966):364-7ExpressionofaVHCkappachimaericproteininmousemyelomacells.17抗血清（多克隆抗体）的制备ForeignproteinsVirusesBacteriaParasitesFungiAntigensBcellBcellactivatedHumoralresponsePlasmacellssecreteantibodies+THcellAntigen+Vertebratebody18多克隆抗血清对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的球蛋白条带缺失（c）。a1a2b白蛋白球蛋白（c）（a）（b）19小鼠体系：半衰期短、HAMA大鼠体系：单抗腹水比小鼠高10倍，易亲合层析人体系：人－鼠杂交瘤、人－人杂交瘤单克隆抗体的制备2021杂交瘤细胞的选择性培养DNA合成的途径：氨基喋呤(Aminopterin,A)糖+氨基酸核苷酸胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)TKTMP次黄嘌呤IMPHGPRT核苷酸前体DNA(Hypoxanthine,H)22融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长）23蛇毒单抗的制备2425鼠源单克隆抗体的应用基础研究细胞抗原研究及鉴定分类细胞受体研究分子克隆及功能研究医学研究及诊断感染性疾病诊断肿瘤诊断及预后判断其它诊断及研究不足：半衰期短、人抗鼠抗体反应（HAMA）26将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术结合起来，对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新组装，转染适当的受体细胞后表达出抗体分子，这种经基因重组的抗体称为基因工程抗体。基因工程抗体概念271.从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA逆转录成cDNA2.PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因3.构建表达载体4.在适当的宿主细胞中表达并折叠成有功能的抗体分子5.筛选出高表达细胞株6.亲和层折等手段纯化抗体片段基因工程抗体基本原理28基因工程抗体人源化(Humanization)抗体29Humanization（Chimeric/ReshapedAntibody)Constantregion(Fc)MouseantibodyAntigen-bindingregion(Fab)Antigen-bindingregionsfrommouseSpecifivantigen-bindingsitesfrommouseChimericantibody(66%)Fullyhuamnantibody(100%)Humanizedantibody(90%)30FR：为CDR的构象提供环境；参与抗体结合位点正确构象的形成；简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的亲和力方法：模板替换较大同源性人FR替换鼠FR表面重塑对鼠CDR及FR表面残基镶饰或重饰－类似人补偿变换CDR移植后更换部分的人FR－鼠定位保留以人FR保守序列为模板进行人源化人源化抗体的构建策略31从同源抗体或抗体的共同序列中选择人源FR确定在FR中起关键作用的氨基酸以鼠单抗可变区的立体模型作指导人源化抗体的构建策略关键目标保持抗体的亲和力降低免疫原性32从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性V区基因，并与人抗体C区基因按一定的方式重组，克隆到表达载体中构建鼠－人嵌合的轻重链基因表达载体，再转入宿主细胞表达，经筛选后制备成特异性的嵌合抗体。人－鼠嵌合抗体概念33PCR鼠抗体基因人抗体基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3嵌合轻链嵌合重链IgG34人－鼠嵌合抗体特点完全保留鼠单抗的特异性和亲和力降低了HAMA不良反应一定的免疫原性，V区完全鼠源性35改型抗体抗体分子轻、重链可变区的6个CDR形成CDR平面直接接触抗原，决定了抗体的特异性，骨架区只是作为支持CDR襻的支架，而且其立体构象极为保守。因此，将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区上，有可能使人单抗获得鼠单抗的特异性，并最大限度地减少鼠单抗的异源性，仅有9%的序列来源于亲本鼠单抗，这种CDR移植的人单抗称为改型抗体。36CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体（改型抗体）鼠单克隆V区人源化（CDR移植）37治疗性抗体的开发几经反复终于形成蓬勃发展-——鼠单抗人源化的技术功不可没。鼠单抗人源化时基本选择IgG同种型，在体内IgG与存在于内皮细胞表面的受体FcRn相互作用，在细胞内受到保护不被降解而具有较长的半衰期。同时鼠IgG通过激活补体和结合Fc受体激发一系列生物效应功能的效率较低，无论是嵌合抗体还是改型抗体均通过使用人恒定区克服了这一缺陷。人源化抗体的评价38对于人源化的最主要的初衷，消除异源性的评价却要复杂的多。除了降低抗体分子的鼠源序列外，其免疫原性还受到其它因素如给予抗体的途径和剂量、病人的病情和免疫状况、抗体所针对的抗原的特性和部位以及抗体本身激活生物学效应的特性等均相关，因此应该综合考虑。人源化抗体的评价39不同种属之间抗体分子可变区的差别远低于恒定区的差别；构建改型抗体要比构建嵌合抗体的工作量大的多，还常常导致亲和力不同程度的降低，付出亲和力和增加研制成本的代价是否值得的问题。人源化抗体的评价改型抗体相对于嵌合抗体的优越性存在质疑：40应当制备配对的改型和嵌合抗体，用于足够量的可比较的人群，观察其诱发抗抗体的生成情况，这是难以做到的。迄今大量临床应用的情况揭示其他影响免疫原性的因素值得重视，因此一味追求序列的同源性而摒弃嵌合抗体是值得商榷的。事实上即使完全人源化的抗体也可以诱发抗独特型抗体，并不可能完全消除治疗性抗体的免疫原性，而这种抗独特型反应的后果如何待进一步观察。人源化抗体的评价欲确切评判人源化对免疫原性的影响：41V区片断，1/3～1/80，具有与抗原结合的功能种类：Fab抗体单链抗体（ScFv）Fv片断抗体单域抗体SDAb最小识别单位MRU小分子抗体42(1)小分子抗体43组成：由重链V区及CH1功能区与轻链二硫键连接，50KD，为完整IgG的1/3。应用前景：较好的渗透性和药代动力学特征HAMA反应存在亲和力较低、稳定性差Fab抗体44将抗体分子的重链V区和CH1功能区的cDNA与轻链完整的cDNA序列重组并克隆到适当的表达载体中在大肠杆菌等宿主细胞中表达整个制备过程包括Fab抗体基因的扩增，表达载体的构建、表达及产物鉴定基因工程手段构建Fab抗体的原理45Fab抗体基因的扩增方法Fab基因扩增的方法主要有二种：采用PCR技术直接从基因组中扩增，但这种方法不确定的影响因素较多。通过RT-PCR技术从cDNA中扩增两种方法成功的关键均取决于PCR引物的设计。不同Fab抗体引物的设计有所不同，但一般均使用同源性较高的序列，其中5’端的引物必须包含克隆位点，3’端的引物除克隆位点外还应含有翻译终止信号。46免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞PrVHCH1PrVLCLFab抗体分子的制备Fab抗体47抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗体分子的制备Fab抗体48单链抗体（ScFv）组成特点VH和VL通过连接肽重组表达分子量小、穿透力强、体内循环半衰期短、免疫原性低可作为其它抗体的基本元件49单链抗体基因的构建一般采用从杂交瘤细胞提取mRNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增其VL及VH基因，再用人工合成的寡核苷酸序列即接头把VL的C端与VH的N端或VH的C端与VL的N端连接，即成单链抗体基因。单链抗体（ScFv）构建方法50VHVL接头DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接头DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的构建变性、复性VL引物VL单链抗体（ScFv）51单链ScFv：抗原含重复抗原决定簇时，亲和力下降8倍以上双价ScFv：改善ScFv的亲和活性双特异性ScFv：与细胞因子IL-2、TNF相连：特异性杀伤应用前景52保持抗体的可溶性接头：长度、V区空间结构组成单域抗体一个VH或VL功能结构域特点分子量小Ig分子的1/12、抗原性弱、穿透力强抗原性弱、相对较粘（疏水面的暴露有关。在全抗体分子中，疏水面被VL遮盖）细菌LPS的单域抗体在杂交瘤细胞中的表达量比亲本单克隆抗体高50倍以上设计原则53最小识别单位(minimalrecognitionunit,MRU)组成高多变区多肽（hypervariableregionpolypeptides,HRP）一个CDR多肽特点设计原理应用16－30氨基酸、抗原性弱、穿透力强非特异性吸附每个CDR的作用不同寻找在抗原识别和亲和力方面有重要意义的CDR抗血小板纤维蛋白原受体CDR3，抑制纤维蛋白原、PACI与血小板的结合54传统单抗分子量大，穿透力弱基因工程小分子抗体穿透力强，亲和力低多价微型抗体双链抗体（diabody）双特异性抗体（bispecificantibody）微型抗体（minibody）三链抗体（triabody）四链抗体（tetrabody）多价微型抗体55VL－VH－CH380kD易于构建及生产血中停留时间长靶部位吸收好CH3-dimerizedscFV微型抗体56LD型LDLEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGFlex型连接肽序列VHVLVHVLCH357价肽取决于连接肽段所形成的聚合物特性多价ScFv与单价ScFv和Fab片断相比，与靶抗原结合的功能亲和力提高四链抗体4helix-stabilizedscFvtetramers58Leucine-zipperstabilizedscFvdimersH