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（一）原核细胞的基因结构（补）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子--一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。终止子--也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区:非编码区:原核细胞的基因结构有调控作用，含启动子、终止子等。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子（二）真核细胞的基因结构(补)编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1.2基因工程的基本操作程序目的基因——主要指编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子。取出DNA用限制酶切断DNA目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的获取基因文库的种类：基因组文库：含有一种生物所有的基因部分基因文库：含有一种生物的一部分基因（如：cDNA文库）获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因基因文库（genelibrary）的概念：将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。组织或细胞染色体DNA限制性核酸内切酶DNA片段重组DNA分子含重组分子的转化菌载体受体菌基因组文库存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。mRNA逆转录酶cDNA双链cDNA重组DNA分子载体含重组分子的转化菌受体菌用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后，建立的基因文库。cDNA文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以基因文库的作用：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获取所需的目的基因获取目的基因的根据：见课本P9PCR(polymerasechainreaction)——多聚酶链式反应是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪原理：反应过程：1.变性：将反应系统加热至90℃-95℃，使模板DNA完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至55℃-60℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：将温度升至70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA呈指数形式扩增。反应体系：DNA双链复制模板DNA、特异性引物（与目的基因的起始段互补）、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸（dNTP）及缓冲液前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物利用PCR技术扩增目的基因PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果四种脱氧核苷酸高温变性解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子模板、能量、酶DNA双链复制DNA合成仪过程：适用范围：已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成获取目的基因方法三：化学合成法小结:目的基因的获取：三种方法(1)从基因文库中获取适用于目的基因序列为未知的情况(2)利用PCR技术扩增适用于目的基因的序列为已知的情况(3)人工合成适用于目的基因不是很大且其序列是已知的基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2、基因表达载体的构建——基因工程的核心构建基因表达载体的目的：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代（2）使目的基因能够表达和发挥作用常用的受体细胞动物、植物、微生物转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。3、目的基因导入受体细胞1）将目的基因导入植物细胞（受精卵或体细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法转化方法2）将目的基因导入动物细胞（受精卵）显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞常用CaCl21）将目的基因导入植物细胞常用方法：农杆菌的特点：适用范围：农杆菌转化法双子叶植物和裸子植物易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。转化过程：1）将目的基因导入植物细胞——基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是籍高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质转化技术。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高此技术最早由我国学者周光宇提出的，植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。1）将目的基因导入植物细胞——花粉管通道法2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌细胞的转化方法：用Ca+（常用CaCl2）处理细菌细胞，以增大细胞壁的通透性，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态——感受态细胞。将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少1)分子水平的检测检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测方法：DNA分子杂交技术检测方法：分子杂交技术检测方法：抗原-抗体杂交4、目的基因的检测和鉴定DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。2）个体生物学水平的鉴定——抗虫、抗病接种实验未转化植株根部转耐盐基因植株根部从左至右盐浓度依次为0，100，200，250，300，350(mmol/L)重组的DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。善假于物也