基因工程步骤

一、学习目标简述基因工程原理及基本操作过程二、学习重点和难点1、基因工程基本操作程序的四个步骤（重点）2、从基因文库中获取目的基因（难点）3、利用PCR技术扩增目的基因（难点）1.2基因工程的基本操作程序真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)启动子终止子非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345转录mRNA前体成熟mRNA加工切除内含子转录部分原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取用3分钟阅读P8-11，并思考下列问题，然后用2分钟与同桌交流、讨论。1、获取目的基因的常用方法有哪些?2、何谓基因文库？其类型有哪几种？3、如何构建基因文库？4、何谓PCR技术？其原理、条件和过程是怎样的？一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成3、基因文库又称DNA文库，将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。按外源DNA片段的来源分基因文库分为：基因组DNA文库：包含了某物种的所有的基因部分基因文库：只包含了部分基因文库（如cDNA文库）1）载体DNA片段的制备DNA分离纯化→限制酶切2）供体DNA片段的制备总DNA分离纯化→酶切法→分离特定大小DNA片段3）载体与基因组DNA片段的连接4）重组DNA转化受体细胞4.基因文库的构建①基因组文库的构建通过对受体菌的培养而储存基因②cDNA文库的构建（反转录法）目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)接到载体③基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以思考：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？根据基因的有关信息如根据基因的转录产物mRNA、基因的核苷酸序列、基因翻译产物蛋白质等来获取目的基因。2、利用PCR技术扩增目的基因—聚合酶链式反应PCR①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物_______复制______________的核酸合成技术③条件：________________________________________________、___________、___________________②原理：________________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制已知基因的核苷酸序列(前提条件)四种脱氧核苷酸成对引物DNA聚合酶(Taq酶）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成_________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链PCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚CPCR总结：3、化学方法人工合成目的基因基因比较小,已知核苷酸序列，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成–从基因文库中获取–利用PCR技术扩增–利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。1、基因表达载体的构建方法2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代（2）使目的基因能够表达和发挥作用。3、基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因等思考：它们有什么作用？表达载体为什么一定要有启动子？•（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达。•（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。终止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。标记基因有什么作用？1、原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径三、将目的基因导入受体细胞2、方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞（1）农杆菌转化法①特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法单子叶植物适用此方法（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2、将目的基因导入动物细胞②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物①方法：显微注射法微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞四、目的基因的检测与鉴定•分子水平检测:–是否插入目的基因–是否转录–是否翻译•个体生物学水平鉴定1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原-抗体杂交（蛋白质是抗原）②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。