基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序目标的获取从基因文库，PCR扩增，人工合成载体构建目的基因启动子终止子和标记基因目标导入目的基因进入受体细胞内检测鉴定基因探针法，生物学水平鉴定等1目标获取▪人工合成▪技术比较2载体构建▪组成▪功能▪步骤3目标导入▪转化▪受体种类▪导入方法4检测鉴定1目标获取编辑从基因文库中获取①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。②基因文库的种类：1、基因组文库；2、部分基因文库。利用PCR技术扩增目的基因①PCR含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核糖合成技术。全称是多聚酶链式反应。②PCR原理：DNA双链复制。③前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。④扩增过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此重复循环多次。⑤结果：每次循环后的目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增。人工合成如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。技术比较DNA复制PCR技术基因克隆场所细胞核生物体外细胞内酶解旋酶、DNA聚合酶Taq酶限制酶、连接酶载体不需要不需要需要遵循原则碱基互补配对碱基互补配对碱基互补配对结果DNA分子DNA分子片段DNA分子片段2载体构建编辑组成1、目的基因；2、启动子；3、终止子；4、标记基因。功能1、使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；2、使目的基因能够表达和发挥作用。步骤⑴、用一定的限制酶切割质粒，使之出现一个黏性末端切口。⑵、用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端。⑶、将目的基因片段插入质粒切口，加入适量DNA连接酶，使目的基因与质粒形成重组质粒。⑷、基因表达载体的构成：目的基因+启动子+终止子+标记基因3目标导入编辑转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。受体种类⑴、微生物：细菌细胞⑵、植物细胞：卵细胞、受精卵、体细胞⑶、动物细胞：受精卵、胚胎细胞导入方法⑴、微生物：感受态细胞法①、感受态细胞：指细菌细胞经过Ca2+处理后，细胞壁透性增强，能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。②、过程：CaCl2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。⑵、植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法①、农杆菌：土壤微生物，易感染双子叶植物和裸子植物；对大多数单子叶植物没有感染力。②、Ti质粒的T_DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。③、过程：目的基因插入T_DNA，T_DNA进入农杆菌，将农杆菌导入植物细胞。⑶、动物细胞：显微注射法①、目的基因表达载体经过提纯备用，取得受体动物的卵（或受精卵）备用。②、采用显微注射技术将目的基因表达载体注射到卵（或受精卵）中。③、培养液培养成为早期胚胎。④、将早期胚胎移植到雌性动物子宫内，发育成新个体。4检测鉴定编辑⑴、检测：①、导入检测：检测受体细胞染色体DNA上是否含有目的基因。DNA分子杂交法（DNA探针法）。②、表达检测：检测目的基因是否完成转录出mRNA。分子杂交法检测RNA。检测目的基因是否完成表达翻译成蛋白质。提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交。⑵、鉴定：个体生物学水平鉴定，鉴定抗性等。课时达标训练(二)基因工程的基本操作程序(时间：25分钟；满分：50分)一、选择题(每小题2分，共20分)1．下列不属于获取目的基因方法的是()A．利用DNA连接酶复制目的基因B．利用DNA聚合酶复制目的基因C．从基因文库中获取目的基因D．利用PCR技术扩增目的基因2．在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要()①DNA连接酶②同一种限制酶③RNA聚合酶④具有标记基因的质粒⑤目的基因⑥四种脱氧核苷酸A．③⑥B．②④C．①⑤D．①②④3．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是()A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济有效B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法4．下列技术依据DNA分子杂交原理的是()①观察DNA在细胞中的分布②检测目的基因是否导入细胞③检测目的基因是否完全转录并翻译④检测目的基因是否进行转录A．②③B．①③C．②④D．①④5.如图为表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是()A．氨苄青霉素抗性基因B．启动子C．限制酶D．DNA连接酶6．基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是()A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团D．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA7．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白8．(江苏高考)下列关于基因工程技术的叙述，错误的是(多选)()A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达9．用某人的胰岛素基因制成的DNA探针，能与之形成杂交分子的是()①该人胰岛A细胞中的DNA②该人胰岛B细胞中的mRNA③该人胰岛A细胞中的mRNA④该人肝细胞中的DNAA．①③④B．①②③C．①②④D．②10．某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒导入大肠杆菌细胞，使其表达，产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是()A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒B．RNA聚合酶是构建该重组质粒必需的工具酶C．可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D．在含氨苄青霉素的培养基中不能生长，但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌二、非选择题(共30分)11．(10分)农业科技工作者在烟草中找到了一种抗病基因，现拟采用基因工程技术将该基因转入棉花，培育抗病棉花品系。请回答下列问题：(1)为了能把该抗病基因转入到棉花细胞中，常用的载体是________。(2)要使载体与该抗病基因连接，首先应使用________进行切割。假如载体被切割后，得到的分子末端序列为，则能与该载体连接的抗病基因分子末端是________(填序号)。A.－G－CTTAAB.－T－AATCCC.－CTTTA－GD.－AAATC－T(3)切割完成后，用________酶将载体与该抗病基因连接起来，连接后得到的DNA分子称为________。(4)再将连接得到的DNA分子导入农杆菌，然后用该农杆菌去__________棉花细胞，利用植物细胞具有的______性进行组织培养，从培养出的植株中________出抗病的棉花。(5)该抗病基因在棉花细胞中表达的产物是()A．淀粉B．脂类C．蛋白质D．核酸(6)转基因棉花获得的________是由该表达产物来体现的。12．(12分)科学家将动物体内能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内表达成功。请据图回答问题：(1)该基因工程操作是采取________的方法获取目的基因(即________基因)的。(2)图中①DNA以______________为模板，________形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的目的基因。(3)②代表________，在它的作用下将质粒(________DNA)切出黏性末端。(4)图中③代表____________，它往往含有________基因，以便对目的基因进行检测。(5)图中④表示______________________，为使此过程顺利进行，一般需将大肠杆菌用________处理，以增大其细胞壁的________。(6)图中⑤表示________随大肠杆菌的繁殖而进行增殖，此基因在大肠杆菌内表达的标志是__________________________________。13．(8分)科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示。根据题意，回答下列问题：(1)基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：______________、______________、______________、______________。(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA______________________________________________的特点。(3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________。(4)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是________________。(5)目的基因能否在棉株体内稳定存在和表达其遗传特性的关键是________________，这需要通过检测才能知道，检测常采用的方法是_______________________________________。答案1．选A对目的基因(DNA片段)进行复制利用的是DNA聚合酶而不是DNA连接酶，DNA连接酶是将DNA片段连接时所使用的酶，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸连接成一条链所使用的酶。2．选A重组DNA分子包括两部分：载体DNA和目的基因DNA。同一种限制酶切割载体DNA和目的基因DNA，DNA连接酶将两者连接，而载体上往往带有标记基因。RNA聚合酶用于RNA的形成，四种脱氧核苷酸则用于DNA的形成。3．选A目的基因导入植物体细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济有效，此外还有基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用Ca2＋处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化过程。4．选C观察DNA在细胞中的分布的基本方法是利用甲基绿对细胞中的DNA分子进行染色，再利用显微镜进行观察。目的基因是否导入以及是否转录出相应的RNA，一般是利用放射性同位素作标记(标记目的基因)，是利用DNA分子杂交原理来实现的。最后检测目的基因是否翻译出蛋白质，其方法很多，一般是利用抗原—抗体杂交的原理来实现。5．选B由X的位置可以判断其为启动子。启动子是表达载体所必需的，功能是启动插入基因的转录过程。氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，但不是必需的标记基因。限制酶和DNA连接酶都不是表达载体所需要的。6．选D从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一切口，与图乙中EcoRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA。7．选D目的基因的表达是指在受体细胞中产生了目的基因所控制合成的蛋白质。在受体细胞中检测到目的基因或其转录产物RNA，并不能表明目的基因已经成功表达。8．选ABC限制性核酸内切酶大多是特异性识别6个核苷酸序列，但也有识别序列由4、5或8个核苷酸组成的，A错误；PCR中耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用，B项错误；载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，不是抗生素合成基因，C错误；目的基因导入