基因工程综述

基因工程综述基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程（geneticengineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（WaclawSzybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔医生奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯（DanielNathans）、亚伯（WernerArber）与史密斯（HamiltonSmith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程。重组DNA技术的基本定义重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程的基本定义狭义上仅指基因工程。是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（MolecularCloning）或基因克隆（GeneCloning）。广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。---基因工程产业化的基本原则。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分。（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。（3）外源基因的导入。（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。（5）外源基因表达产物的生理功能的核实。（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析。（7）生态与进化安全保障机制的建立。（8）消费安全评价。近年来出现了一大批利用基因工程改造生物改造自然的实例。1.环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC2．4．1．19)是一种多功能酶，主要用于生产环糊精(CD)、糖基化碳水化合物，同时在食品行业也有重要作用。自然界中产CGTase的微生物主要为Bacillus、Paenibacillus、Klebsiella、Thermoanaerobacterium、Thermoanaerobacter等［3］。不同来源的CGTase，由于宿主的蛋白质合成、修饰和转运过程各自不同，其性质差别很大。已发现的CGTase仍不能达到工业化生产的条件，人们仍需努力探索，筛选出性状新和特性优的CGTase。最近研究人员利用基因改造和异源表达策略发现新CGTase基因序列及它们表现出的一些新性质。Lee等［4］在Pyrococcusfuriosus中发现新CGTase基因序列，然后把该基因转入Escherichiacoli表达，得到热稳定性高的CGTase(最适温度:90℃);Go等［5］从AlkalophilicBacillussp．BL-31分离得到的新β-CGTase，具有专一性强的分子间类黄酮转糖基作用;Atanasov等［6］、Kitayska等［7］从Bacilluspseudalcaliphilus8SB分离得到一种新CGTase，可高收率转化淀粉为β-CD和γ-CD［6-7］。2.利用基因工程技术表达能够促使肿瘤细胞DU145凋亡的肿瘤坏死因子α（TNFα）的衍生物TRSP10，并在体外研究其对DU145细胞的抑制效应。以重叠延伸PCR方法合成TRSP10基因序列，并插入高效表达的质粒载体pKYB-MCS的NdeⅠ和SapⅠ酶切位点之间，优化融合蛋白诱导表达的条件，建立了从载体构建到重组菌表达、制备的工艺技术条件。3.里氏木霉(Trichodermareesei)被认为是最合适联合生物加工(consolidatedbioprocessing)的微生物之一。原始里氏木霉菌株产乙醇能力太低，需要进一步提高其产酒量。我们通过基因组重排技术提高了里氏木霉菌株产乙醇能力和乙醇耐受力。首先对CICC40360菌株孢子进行NTG诱变得到正向突变菌株，再以此为出发菌株进行基因组重排。进行基因组重排后，重组菌株在含不同乙醇浓度的原生质体再生培养基上进行筛选。突变菌株和原始菌株一起做摇瓶发酵实验进行比较以确定产乙醇能力的提高。经过两轮基因组重排后，筛选获得表现最优异的重组菌S2-254。该菌株能在利用50g/l葡萄糖发酵出6．2g/l乙醇，同时能耐受3．5%(v/v)浓度乙醇。上述结果表明，本实验采用的基因组重排技术能够有效而且快速获得具有目的性状的优良菌株。4.随着低温灾害发生频率增加，水稻耐冷育种研究已经成为保障水稻生产的一个重要内容，利用基因工程技术提高水稻耐冷性是一条优于传统育种的有效途径。根据低温信号转导途径，将耐冷基因分为三类:蛋白激酶(CDPK，MAPK等)基因、转录因子(ICE1/ICE-like，CBF/DＲEB，MYB等)基因、功能基因(合成渗透调节物质基因、脂肪酸去饱和代谢关键酶基因等)植物耐冷性大多是受多基因控制的复杂性状，而且还会与其他环境胁迫因子发生交叉作用，耐冷机理复杂，从而导致传统育种方法在良植物耐冷性方面受到限制。利用现代分子生物技术发掘利用优异的基因资源来改良植物的耐冷性，是提高植物耐冷丰产能力最为有效的途径。目前，低温信号转导途径主要分为依赖CBF(CＲT/DＲEbindingfactor)的信号转导途径和不依赖CBF的信号转导途径。在依赖CBF的信号转导途径中，细胞首先通过改变膜的流动性和蛋白构象接受冷信号，并且激活Ca2+通道，Ca2+受到低温诱导浓度瞬时增加，使信号转导途径中的CBF上调表达，进而调控其下游低温胁迫相关功能基因表达上调［2－3］。在不依赖CBF的信号转导途径中，下游低温胁迫相关功能基因的表达受到CBF之外的转录因子(MYB，SNAC等)或其他因素(例如ABA)的诱导，对该途径的研究没有依赖CBF的信号转导途径系统、全面、深入。根据低温信号转导途径，本文从蛋白激酶(CDPK，MAPK等)基因、转录因子(ICE1/ICE-like，CBFDＲEB，MYB等)基因、功能基因(合成渗透调节物质基因、脂肪酸去饱和代谢关键酶基因等)三方面详细阐述耐冷基因在水稻耐冷基因工程育种中的最新研究进展，以期为耐冷基因的利用及农作物耐冷遗传改良和育种提供参考。小结基因工程的现状与展望。一、基因工程应用于植物方面农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。二、基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。三、基因工程应用于环保方面工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把