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基因工程：按照人们的的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的心的生物类型，这就是基因工程。又称重组DNA技术或遗传工程。核酶：是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。核酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。插入失活：当外源DNA插入到载体的某一基因中间时，该基因就不能表达，这种现象称为插入失活。结构基因：包括以5端mRNA转录位点开始到3端mRNA终止信号结束的全部功能单位。目的基因：决定生物的优良性状，具有应用价值的应用前景，并被用于构建物种新特性的基因。操纵子：功能密切相关的基因聚集在一起，处于同一转录启动的调控之下，并且有相同的转录终止区。启动区：RNA聚合酶识别，结合和开始转录的一段DNA序列。终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供转录终止信号的DNA序列。终止因子：帮助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子。双元载体：即能在宿主自我复制，又能转化感染其它宿主的载体。穿梭载体：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭）载体的分类：按载体的来源分：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、植物病毒载体、动物病毒载体、人工染色体等。按用途分：克隆载体：主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体，其上有复制子即可。表达载体：用于一个基因的蛋白表达，是在常规载体的基础上衍生而来，这类载体既有复制子，更要有强启动子。穿梭载体：含有两个不同的复制子，能在两类不同的受体细胞中复制。人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。其装载外源DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美温和噬菌体：λDNA可以整合到宿主细胞染色体，以溶源状态存在并随染色体的复制而复制。插入型载体：当外源DNA片段插入后使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶菌周期。质粒载体的特性：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的双链共价闭合的环状DNA分子，依赖宿主细胞的存在表达序列标签：EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到7000bp不等，平均长度为360±120bp。EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料称为基因文库。移动基因：能从染色体的一个位置转移到另外一个位置，甚至在不同的染色体之间跳跃的基因。断裂基因：基因内部插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干片段。重叠基因：两个基因内部存在重叠的读码框。限制性核酸内切酶：是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。DNA连接酶：能催化双链DNA片段靠在一起的3′羟基末端和5′端磷酸基团末端之间形成的磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。DNA聚合酶：作用是指在引物和模板的存在下，把脱氧核糖核苷酸（dNTP）连续地加到引物链的3’–OH末端，催化核苷酸的聚合作用同裂酶：来源不同，识别位点和切割位点均相同的限制性内切酶。即同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同裂酶对识别序列的甲基化状态有不同的限制性反应。同尾酶：来源不同，识别序列也不相同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。同位酶：识别序列相同，但切割位点不同引物：是人工合成的与模板DNA互补的寡核苷酸序列。基因文库：是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应基因组文库：将某个生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上，贮存在一个受体菌的群体之中形成的集合。cDNA：与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成cDNA文库：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。载体：指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，它的本质是DNA复制子。多克隆位点：载体上具有一种或多种单一限制性内切酶位点，且在此位点上插入外源基因片段不影响本身的复制功能。转化：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。转染：指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。转导与转染的区别：转导是通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径白外援DNA转移到受体细胞的过程，转染是λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程原位杂交：将细胞或组织的核酸固定保持在原来的位置上，然后用探针与之杂交的一种核酸分子杂交技术，该方法可较好地反映目的基因在细胞或组织中的分布和表达变化。转化子:导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。重组子：两个位于不同载体或染色体上的突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。重组子另一定义是指，含有重组DNA分子的转化细胞。插入失活：把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表型特征。感受态细胞：处于能吸收环境DNA分子的生理状态的细胞。融合蛋白：将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达，由这种杂合基因表达出的蛋白质成为融合蛋白。包涵体（IB）：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构。转基因：转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。PPT：苯丙氨酸丙酮酸氨基转移酶1、常用植物基因转化方法特点比较。转化方法农杆菌法PEG法点击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖生物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂程度简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛2、插入失活例子：答：PBR322有四环素抗性基因和氨卡青霉素抗性基因，在四环素抗性基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶切位点，如果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致四环素抗性基因失活。将转化后的细胞分别培养在含氨卡青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。3、TAC载体的蔗糖致死和卡那霉素抗性：答：蔗糖致死：TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H/sacB，它们有sacB蔗糖致死基因作为插入子的选择标记，以HindⅢ酶切位点为克隆位点。sacB基因编码果聚糖蔗糖酶，催化从蔗糖转移果糖残基到各种受体蛋白上，影响受体正常功能。当琼脂培养基中含有5%蔗糖时，sacB基因产物能使大肠杆菌和农杆菌致死。当有外源DNA片段插入到TAC载体的克隆位点后，sacB基因失活，阳性克隆在含有5%的蔗糖的琼脂培养基中可以生长，而未插入外源基因的阴性克隆致死。卡那霉素抗性：4,、蓝白斑筛选：答：这种方法是根据α互补的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌—半乳糖苷酶的α基因片段（LacZ’），携带有lac基因片段的载体转入LacZ’－的宿主菌后，在IPTG（异丙基硫代-β-D半乳糖———半乳糖苷酶，该酶可以分解无色的5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)得到蓝色的5—溴—4—氯—靛蓝，因此在含有X-gal平板上形成浅蓝色的菌斑。外源基因插人LacZ’(或LacZ’基因部分被取代)后，重组的克隆将丧失分解X-gal的能力，在含有X-gal的平板上形成白色的菌斑，非重组的克隆则为蓝色菌斑。5、大肠杆菌基因表达系统：答：大肠杆菌基因表达系统主要分为两种：①组成型基因表达系统，它是不需要加入诱导剂就可以在细菌生长过程中持续表达的②诱导型基因表达系统，它是在加入诱导剂后才能诱导基因的表达，诱导剂包括化学小分子、金属离子等。优点：①对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解②是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体③许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效，高水平的表达④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。不足：①真核基因，在结构上同原核基因之间存在很大差别②真核基因的转录信号同原核不同③真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异④细菌的蛋白酶能识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。⑤大肠杆菌周质内存在各种内毒素。6、酵母细胞基因表达系统：答：酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适用于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质是生产制备用工具。优点：①对其遗传学和生理学的研究比较深入②小量培养和大规模反应器中都能生长③已经分离出很强的启动子④有翻译后的加工⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不需要宿主的安全性检验。缺点：①表达量普遍低②常常发生质粒丢失③重组蛋白常常超糖基化④分泌困难，分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙⑤酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。常用酵母表达系统：①酿酒酵母表达系统②甲醇营养型酵母表达系统③裂殖酵母表达系统。8、乳糖操纵子原理：答：当细胞中没有乳糖或其他诱导物时，乳糖操纵子处于阻遏状态，阻遏蛋白结合在操纵基因O上，阻止了结合在启动子P上的RNA聚合酶向前移动，使转录不能进行，结构基因无法表达，当细胞中有乳糖或其他诱导物时，乳糖便与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化，从而不能结合到操纵基因O上，于是转录得以进行，并翻译出吸收和分解乳糖的酶。9、限制性内切酶种类比较：答：Ⅰ型：切割位点在识别位点1000bP以外，无特异性，需ATP、镁离子S-腺苷蛋白氨基。Ⅱ类：识别相反方向结合的同源二聚体，内切酶与甲基化酶分开。Ⅲ类：二亚基双功能酶，在切割24-26bP处切割。10、转录区终止子的特点：答：终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供转录终止信号的DNA序列。终止因子：帮助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子。特点：⑴回文结构，转录后可形成发夹结构从而使聚合酶减慢或停止前进。⑵不依赖于终止因子的终止子含有寡聚T序列和一段富含GC序列。⑶依赖于终止因子的终止子，不含寡聚T序列，回文结构不含富GC的序列。11、基因文库构建的一般步骤：CDNA文库构建步骤：⑴载体的选择和制备（1）总mRNA的制备分离⑵高纯度、大分子量基因组DNA的提取（2）CDNA的合成⑶基因组DNA的部分酶切与分级分离（3）双链CDNA的合成⑷载体与DNA片段的连接（4）双链CDNA与载体重组⑸转化或侵染宿主细胞（5）重组载体导入宿主细胞⑹筛选鉴定基因组及保存（6）筛选目的基因12、Ti质粒五个区：答：（1）LB与RB之间的T-DNA，这段序列螯合到植物基因组中（2）质粒转移区（3）冠瘿代谢区（4）复制原点：该区基因调控Ti质粒的自我复制起始（5）毒性区13、转基因动物方法：答：（1）显微注射法（2）逆转录病毒感染法14、逆转录病毒生命特征史。答：反转录病毒的最基本特征是在生命过程活动中，有一个从RN