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第一章基因工程：在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，将外源基因通过在体外重组导入受体细胞内，使这个基因在受体细胞内复制、转录、翻译表达的过程。基因工程药学：应用基因工程技术，研制和开发核酸、多肽和蛋白质药物的理论、方法和应用的一门学问。基因工程药物的特征：第一，基因工程药物来源的过程应当是外源核酸分子在不同种寄主细胞中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置在新的生物细胞中，而这种生物与原生物毫无亲缘关系。第二，所表达基因工程药物的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，实现很少量的DNA样品拷贝出大量的DNA分子，而且是大量的没有任何其他DNA序列污染的，绝对纯净的DNA分子群体，再由这些DNA分子群体经转录、翻译、翻译后蛋白质折叠、修饰最后成为具有生物活性的基因工程药物。基因工程药学的主要研究内容：一，用基因工程技术制备体内缺乏的多肽或蛋白质，来替代或补充体内对这类活性多肽或蛋白质的需求。二，研究蛋白质的生物学活性。三，研究基因工程药物的临床应用。基因工程技术方法：1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、阳性克隆的筛选鉴定5、表达蛋白的生产和纯化6、理化、生物活性和毒性的一系列检测。第二章基因克隆主要包括：1、连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子2、将重组DNA分子导入受体细胞，使外源基因随受体细胞的分裂而复制、扩增。限制restriction：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段。修饰modification：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶所识别切割。平末端bluntorflushend：有些限制性核酸内切酶能够在识别序列中间的同一个位置进行将DNA双链切断，产生的DNA末端为平末端。产生的平末端DNA可以任意连接，但连接效率低。黏性末端stickyend：大多数的限制性核酸内切酶在两条链错开2~4个核苷酸处切断，这样产生的DNA末端带有5‘突出或者3’突出的DNA单链，这样的末端称为黏性末端。连接效率高，从3‘末端切割的产生的是3‘黏性末端，5’末端切割的产生的是5‘黏性末端。位点偏爱sitepreference：有些限制性内切酶对同一底物的不同位点表现出偏爱切割的特性，即对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率。这种现象就叫做位点偏爱。熟悉：酶切反应条件1、缓冲液：缓冲剂，Mg2+，DTT(二硫苏糖醇)，BSA（小牛血清白蛋白）分为三组低盐组（0~50mmol/L）、中盐组（50~100mmol/L）、高盐组（100~150mmol/L）2、限制性内切酶的反应温度一般为37℃（Taq为65℃，ApoI为50℃）3、反应时间：通常为一个小时或者更多，酶延长反应时间，可减少酶的用量4、终止酶切反应的方法：EDTA螯合镁离子（10mmol/L）、加热（65℃或80℃处理20min）、苯酚抽提去除蛋白和试剂盒纯化DNA（用于耐高温的）星号活性staractivity：指在非最适的反应条件下，有些酶的识别特异性会降低，表现出松弛的专一性避免的星号活性方式：1、较少的甘油浓度2、保证反应体系内无有机溶剂3、减少酶的用量，防止过度酶切4、控制酶切反应的pH5、适当提高缓冲液离子强度。甲基化酶用于保护宿主的DNA不被相应的限制酶所切割。DNA聚合酶的共同特点：都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加入双链DNA分子引物链的3’-OH末端；催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板链上解离的情况。DNA聚合酶I有三种不同的酶催活性：①5‘→3’的聚合酶活性。②5‘→3’的核酸外切酶活性。③3‘→5’的核酸外切酶活性。熟悉：DNA聚合酶I可以被分割成两个片段①具有完全的5‘→3’的核酸外切酶活性。②具有完全的5‘→3’的聚合酶活性和3‘→5’的核酸外切酶活性。KlenowDNA聚合酶：具有DNA聚合酶I的5‘→3’的聚合酶活性和3‘→5’的核酸外切酶活性。用途：1、修补经限制性核酸内切酶产生的3‘隐蔽末端。2、标记DNA片段的末端。3、合成cDNA克隆中cDNA的第二条链。4、DNA序列测定。5、DNA定点突变。T7DNA聚合酶的优点：1、持续合成能力强，一旦与模板链结合就会不间断的合成互补链2、3’→5‘外切酶活性强，单链和双链都能水解3、不受DNA二级结构的影响，其他合成酶受DNA二级结构的影响。第三章基因组文库和cDNA文库的异同两者获取核酸的来源不同，基因组文库来源于染色体DNA，cDNA文库是从细胞中分离总RNA和mRNA，然后以mRNA为模板反转录合成cDNA，与载体相连，转化宿主细胞而成。两者建库的技术路线不同，产生的基因结构不同，应用也不同。如果研究的目标是要弄清楚一种蛋白质的氨基酸序列，则可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推导。如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或者是在mRNA分子中不存在的某些特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。在mRNA群体中有些mRNA的拷贝数很多，它们的量几乎占总mRNA的50%~90%，但种类却很少，被称为高丰度mRNA。另外的一些mRNA拷贝数很少，低于总mRNA的0.5%，但种类却很多，称为低丰度mRNA。第四章聚合酶链式反应PCR：是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的技术，又称为无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法。它与分子克隆和DNA测序并称为分子生物学的三大主流技术，构成了分子生物学的主要实验基础。PCR的基本原理：与细胞内DNA复制相似，以拟扩增的DNA分子为模板，一对与模板链分别互补的寡聚核苷酸片段为引物，在耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制，沿着模板链上延伸合成新的DNA。PCR的步骤：一、变性通过升温使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成作为反应模板链的单链DNA。变性的温度由G+C的含量决定，含量越高，解离温度越高。变性的时间由模板DNA的长度决定，长度越长，解离时间越长。二、退火将反应体系冷却至特定温度，使引物与模板DNA的互补区结合，形成模板-引物复合物。退火温度过高，则使引物和模板DNA不能很好地结合，扩增效率下降。退火温度过低，则使引物非特异性的和模板DNA结合，形成非特异性DNA片段。退火温度通过预实验来确定，一般比引物与模板的熔解温度Tm低3~5°三、延伸将反应体系的温度提高至热稳定DNA聚合酶的最适工作温度，并维持一段时间。一般的Taq酶最适工作温度为72~78。在耐热DNA聚合酶的作用下，引物为起点，以4种单核苷酸为底物合成新的DNA链PCR反应的五要素：Mg2+，引物，4种脱氧核糖核苷酸混合物，模板DNA，TaqDNA聚合酶PCR反应体系一般包括7个组分：二价阳离子，一价阳离子，缓冲液，一对寡核苷酸引物，热稳定DNA聚合酶，模板DNA，脱氧核苷三磷酸引物设计的一般原则：1、引物的长度一般在18bp~25bp，常用为20bp2、两个引物的Tm差异最好在2~5°，保证两个引物的正确退火。3、引物的碱基：G+C的含量最好在40%~60%之间，含量过少则导致扩增效果不好，含量过多则导致非特异性条带的出现，ATGC最好随机排布，避免出现4个以上嘌呤或者是嘧啶连续排列。4、避免引物内部或两个引物的核苷酸序列互补，从而减少引物二聚体的形成和引物二级结构的形成5、3’端最好是G或者C，不要GC连排6、引物的3’端必须与模板互补，5‘端可以不互补。实时定量PCR的定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析。原理：正常状态下，该探针的5’端报告荧光基团的激发光被3‘端的猝灭基因所抑制而无法被检测到。在PCR退火过程中，该探针与模板结合且结合位置在两个引物之间。在延伸阶段，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光基团的结合位置时发挥其5’→3‘核酸外切酶的活性将荧光探针切断，此时5’端的荧光基团被释放且产生可以被检测到的荧光信号。临界点循环数Ct：在PCR管内荧光信号达到了设定的临界点时所需循环数。起始拷贝数越多Ct越小。第五章原核细胞表达系统的优点：成本低廉，生产量高，操作简单，蛋白表达量高。缺点：缺乏适当的转录后和翻译后加工机制，所以只能表达克隆的cDNA，不宜表达基因组DNA，而从真核细胞来源的蛋白质在其中无法正确折叠和糖基化修饰，表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，为后续纯化带来一定的困难。理想的基因工程载体共同特征：1、本身是复制子，具有自主复制能力2、易于从宿主细胞内分离纯化3、有克隆位点，常具有多个酶切位点4、有选择性标记，利于重组体的筛选和鉴定5、分子量较小，易于操作和利于容纳较长的DNA片段6、具有较高的遗传稳定性严紧型质粒：其复制与宿主细胞染色体的复制偶联，且每个细胞中只有1到十几个拷贝数松弛型质粒：其复制与宿主细胞染色体复制不偶联，每个细胞中有几十个到几百个拷贝数，更重要的是其拷贝数在宿主细胞蛋白质合成和染色体复制停止时仍能继续扩增。噬菌体载体的优点1、能携带外源DNA片段长度较大，且感染能力大于质粒转化细菌的能力2、可以克隆较大的外源基因黏粒载体（柯斯质粒）特点：1、具有langda噬菌体的某些特性：能携带合适的外源DNA，在体外被包装成噬菌体颗粒之后，能高效转导对langda噬菌体敏感的的大肠埃希菌。2、具有质粒的某些特性：具有质粒复制子，在宿主细胞内能像质粒一样复制，并且在氯霉素的作用下，获得进一步的扩增。3、具有高容量的克隆能力。4、具有与同源序列的质粒进行重组的能力。宿主细胞的条件：1、易于重组子的导入2、限制酶和重组酶的缺陷3、遗传稳定性好4、安全性高5、功能互补6、具有较好的翻译后加工机制7、蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低重组体导入宿主细胞的方式1、转化transformation：将质粒或者是重组质粒DNA导入大肠埃希菌细胞内，并使其获得新的表型的过程。2、感染infection（转导transduction）：以噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外被包装成具有感染能力的病毒或者是噬菌体颗粒，感染适当的细胞，并在细胞内扩增的过程。3、转染transfection：指将重组表达载体导入真核细胞的过程。外源蛋白：包涵体，融合蛋白，整合型外源蛋白，寡聚型外源蛋白，分泌型外源蛋白第六章真核表达组件：复制子，启动子和增强子，加polya信号，剪接信号，选择性标记基因哺乳动物基因表达载体的类型质粒型表达载体SV40病毒载体特点：1、可以在各种哺乳动物转染细胞中获得低水平到中等水平的表达，但转染COS细胞可获得高水平表达。2、可以用于表达基因组DNA和cDNA。3、一般作为为瞬时性表达系统。4、一般含有复制起点，启动子，加polya信号等调控序列。5、多数还带有剪接供体和受体信号。反转录病毒载体痘苗病毒载体腺病毒载体特点：1、基因组小，易于操作。2、有多个外源基因插入位点。3、腺病毒不整合到宿主细胞染色体上，不会引起插入突变。4、腺病毒致病性小，重组腺病毒结构稳定。哺乳动物基因表达的宿主细胞CHO细胞：1、具有准确的转录后修饰功能。2、适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达。3、既可贴壁生长，又可悬浮生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力。4、对培养皿要求低，可在无血培养皿中培养。COS细胞：1、细胞易于培养和转染。2、能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的质粒载体快速扩增。3、能瞬时大量表达外源基因的产物。鼠骨髓瘤细胞昆虫细胞表达系统杆状病毒的生物学特性杆状病毒属于双链DNA病毒，基因组庞大，在昆虫细胞内复制和转录，复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，绝大多数的杆状病毒可以产生病毒多角体，病毒多角体主要由多角体蛋白组成，位于被感染的昆虫细胞核中。形成多角体的细胞死亡后，可以经多角体将病毒传染给其他昆虫细胞。杆状病毒的重组与筛选P76酵母菌基因表达载体的类型整合型质粒载体YIp：1、转化率低2、不能在酵母细胞中自主复制3、整合到酵母的染色体上4、不能从酵母细胞中提取载体自主复制型质粒载体YRp