基因工程药物设计

基因工程药物设计目的基因的获得反转录法1、mRNA的纯化：真核细胞mRNA3’端有一多聚腺苷酸-polyA，用亲和层析法mRNA从细胞中分离出来2、cDNA的第一链合成：mRNA3、cDNA第二链合成：用碱解或RNaseH酶解法除去cDNA-mRNA中的mRNA,再以cDNA为摸板合成第二链，再用核酸酶SⅠ酶切除单链DNA。4、cDNA克隆：克隆载体有：质粒DNA、噬菌体DNA载体转导或转化宿主细胞5、cDNA文库鉴定：根据表型进行筛选如抗性基因失活法、菌落颜色变化等6、目的cDNA克隆的分离和鉴定：分离方法：核酸探针杂交法：根据目的基因蛋白质纯品aa序列分析，人工合成单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)mRNA经反转录合成cDNA第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特殊引物协助下，利用PCR扩增，特异地合成目的cDNA链，用于克隆重组化学合成法较小分子蛋白质或多肽的编码基因在已知其核苷酸序列的条件下，化学合成此基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短序列，再退火成两端形成黏性末端的DNA双链片段基因筛选编码序列富集法利用磁场力对cDNA文库中的目的基因进行富集；将质粒DNA库酶切后连上接头，用5’端以生物素标记的与街头序列相同的引物序列进行PCR扩增。将cDNA文库的插入片段同样扩增后，两者杂交得到带有生物素的DNA双链，溶液加入含磁珠核心的链霉抗生素蛋白，加外磁场，目的基因与其他DNA片段分离被富集岛屿获救PCR法直接从已测序的基因组DNA上寻找编码序列，计算机分析找出开放阅读框，外显子陷阱法或寻找CpG岛克隆编码基因CpG岛（CpGislands）含有大量胞嘧啶C、鸟嘌呤G的DNA片段，在基因组DNA中均匀地分布着Alu序列（Alu重复序列属于SINE家族，序列中有限制性内切核酸酶Alu的识别序列AGCT）利用这两段序列，给CpG岛特有的限制酶切割后片段加上泡状接头，再用泡状引物和Alu特异性引物进行PCR扩增，电泳分离出特异片段作为探针对cDNA文库筛选功能克隆法利用基因敲除RNA干扰酵母双杂交高通量筛选流式细胞术等从基因蛋白质表达调控等多水平获得基因功能信息构建cDNA文库EST提供引物信息，PCR扩增特异片段差异显示技术的应用mRNA差异显示减数PCR差减杂交等技术寻找新基因*对已发现基因的改造基因修饰及点突变研究基因新功能基因表达构建表达载体获得目的基因后，选择合适的宿主进行表达，基因表达的微生物宿主有两类：原核细胞，以大肠杆菌，枯草杆菌，链霉菌等为主；真核细胞，有酵母和真菌等。大肠杆菌体系中的基因表达Pbv220系统组成：来源于pUC8多克隆位点核糖体rrnB基因终止信号pBR322第4225～3735位pUC18第2066～680位λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子pRC23的PL启动子及SD序列pBG-2系统pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白具有与IgG结合的活性，可用亲和层析简化下游工艺pET系统插入基因的转录和翻译系统来源于T7噬菌体。表达由位于宿主细胞染色体上的T7-RNA上宿主细胞染色体上的T7-RNA聚合酶控制，T7-RNA聚合酶启动子为lacUV5,由IPTG诱导酵母体系中的基因表达Yep类（yeastepisomalplasmid酵母附加体质粒）YRp类（yeastreplicationplasmid酵母复制型质粒）YCp类（yeastcentromericplasmid酵母着丝粒质粒）YIp类（yeastintegrativeplasmid酵母整合型质粒）克隆载体：向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记。表达载体：可引入外源基因在酵母细胞内保存复制并随酵母分裂传递到子代DNA中体外重组DNA连接酶:大肠杆菌DNA连接酶：二磷酸吡啶核苷酸为辅助因子T4噬菌体DNA连接酶：ATP为辅助因子（多用）T4噬菌体DNA连接酶作用机制黏性末端链接设定连接温度37℃，12-15℃过夜载体：外源DNA=1：3并用碱性磷酸酶处理载体防止载体自身环化转化与感染将外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞进行DNA分子转化吸附：完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面转入：双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译脂质体介导的融合作用脂质体即人工细胞膜,磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜,从而形成一种囊状物被称为脂质小体，具有膜融合及内吞作用.最早证明脂质体能把DNA十分有效地引入动物细胞的实验是从鼠/人杂种细胞系(HGPRT-)中分离出的中期染色体包裹到脂质体中,并用以转染HGPRT-的细胞,结果转化率比裸露染色体高十多倍,而且转化子能稳定地表达HGPRT-的活性.脂质体转化效率高,可以瞬时转染，也可以转染体内基因重组克隆的鉴定分析重组DNA的鉴定根据重组体表型进行筛选鉴定：抗性基因失活法：载体的抗药性基因内具有限制酶的识别位点，用某种限制酶消化并再此位点插入外源DNA时，抗药性基因不再被表达，当这个重组载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转为敏感，便可筛选出重组转化子β-半乳糖苷酶基因插入失活法：质粒载体上LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶N端与受体细菌编码的C端片段实现а互补而具有酶活性，可在IPTG诱导下分解生色底物X-gal并形成蓝色菌落，但当外源片段插入质粒的多克隆位点后，使β-半乳糖苷酶的N端失活从而破坏а互补，因此带有重组质粒的细菌将产生白色菌落，从而可依据菌落的颜色筛选出可能带有重组质粒的转化子菌落原位杂交法：以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子，配合使用可定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，可对基因表达定性定位分析探针标记→纯化→(变性)↓→涂覆乳胶→放射自显影原位杂交→杂交体探测：→加酶联抗体→加酶底物显色↑→金银染色样品制备→切片→通透处理免疫分析法：放射性抗体测定：转化混合物培养重组DNA的分析：重组质粒分离及再转化：限制酶分析：双酶消化用于构建物理图谱eg:由载体PBR322与海象染色体DNA片段构成PWAL1重组质粒，已知海象染色体DNA片段与载体PBR322各自只有一个SalⅠ、EcoRⅠ酶切位点，故采用SalⅠ和EcoRⅠ双酶消化分析PWAL1重组质粒，同时用载体PBR322双酶消化分析对照构建物理图谱印记转移技术基因工程菌的稳定性（载体质粒的稳定性）基因工程菌的组建eg:干扰素的制备诱生的白细胞→提取全RNA→通过寡dT-纤维素柱→蔗糖密度梯度获得寡A的mRNA离心提取12s的mRNA→逆转录成cDNA→双链cDNA接上dT或dG尾→pBR322质粒→pBR322质粒加上dA或dC→退火获的杂交质粒→转化大肠杆菌k12→扩增杂交质粒→筛选抗四环素但对氨苄→用已知干扰素的DNA片断作为青霉素敏感细菌克隆探针挑选富有干扰素cDNA克隆→将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达提高质粒稳定性两阶段培养法：培养前期重点优化工程菌的生长条件，最适pH保持6.8~7.4；后期重点优化外源蛋白的表达条件，最佳pH6.0~6.5培养中加入选择性因素：通过调控环境参数温度pH培养基组分溶解氧浓度限制性营养物质来控制生长速度控制培养条件改变含质粒和不含质粒菌的生长速率差异分离纯化细胞收集：离心法膜分离法细胞破碎：机械/非机械破碎法固液分离重组蛋白质的分离纯化1.离子交换层析非蛋白质类杂质的去除变性蛋白的复性包涵体蛋白复性稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制，可以采取一次稀释、分段稀释和连续稀释透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，无法应用到生产规模超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间质量控制化学检定法:Lowry法、电泳法、高效液相色谱法肽图分析:银染SDS-PAGE微量肽图法：CNBr裂解较大肽片段RP-HPLC法：胰蛋白酶裂解有肽段外源DNA残留量的测定:杂交分析宿主细胞蛋白杂质的检测点－免疫结合测定:eg:基因工程药物实例集落刺激因子工程菌的组建(1)RT-PCR法制备GM-CSFcDNA从正常人血中分离出单核细胞，提取总RNA；引物设计：引物１：5‘端增加有EcoRⅠ酶切位点，起始密码子，5个组氨酸密码子和凝血酶切位点引物２：5‘端加一个终止密码子和一个BamHⅠ酶切位点(2)GM-CSF重组表达载体的构建PCR扩增产物和质粒pBV220双酶切后,重组连接，挑选氨苄青酶素抗性转化子，经酶切筛选、鉴定，阳性重组子命名为pGM09(3)rhG-CSF基因工程菌的培养与发酵发酵用工程菌种的筛选将保存的菌种接种到LB琼脂平板上，过夜培养。挑取单菌落进行液体培养，取少量经热诱导培养后，用SDS-PAGE分析选取表达量最高的克隆作为发酵用种子发酵培养基的选用将工程菌接种于4种发酵培养基中进行发酵，比较诱导表达结果及收菌量，选取合适的发酵用培养基