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生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17【点击数：482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅拌速度的增加，对泡沫和发酵液粘稠度的影响。另外，工程菌的生长和繁殖也会使温度和PH值发生变化，也要及时进行调整在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量。如果使用全自动发酵罐系统，发酵参数由计算机程序控制，则会大大完善高密度发酵工艺，因为程序化控制会使发酵参数自动达到最佳状态，而且参数的改变比手动要温和、平稳，这些都对工程菌的生长繁殖极为有利。以上几个方面是建立工程菌发酵工艺的关键，对基因工程中的大多数工程菌来说，只要综合考虑，严格控制，都会建立起成熟稳定的高密度发酵工艺。3．器材及试剂（1）仪器发酵罐、冷冻高速离心机，可见光分光光度计，恒温培养箱。（2）试剂①菌种和质粒宿主菌为BL21，表达质粒pET24aSA-IL-2和pET24aSA-GM-CSF由本研究所构建和常规保存。②LB培养基（pH7.0）蛋白胨10g/L酵母粉5g/LNaCl10g/L高压灭菌20min，用时加入卡那霉素③2Y培养基（pH7.0）蛋白胨16g/L酵母提取物10g/L氯化钠4g/L高压灭菌20min，用时加入卡那霉素④半合成培养基（pH7.0）(NH4)2SO41.8g/LNH4Cl0.3g/L蛋白胨4g/L酵母粉2.25g/L甘油10g/L磷酸盐适量(KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4·12H2O=2∶4∶7)微量元素MgSO4·7H2O0.3g/L高压灭菌20min，用时加入卡那霉素⑤补料基质（pH7.0）酵母粉5g/L蛋白胨10g/LMgSO4·7H2O0.6g/L甘油170g/L高压灭菌20min，用时加入卡那霉素⑥Bradford蛋白浓度测定试剂盒4．实验步骤（1）发酵用菌种的筛选取一管冷冻保存的甘油菌，用接种环接种于LB平板上，37℃培养过夜，随即挑选单克隆菌种于含有5mLLB培养液的试管中，30℃培养至A600nm为0.4～0.6时，IPTG诱导表达，离心收集菌体，进行SDS-PAGE以检测表达情况。将表达量最高的克隆作为发酵用种子,分装冷冻保存，每批发酵取出一管,以保证菌种的稳定性。（2）工程菌的培养①种子的活化：取冷冻保存的工程菌株划板，37℃培养约16h，挑单克隆接种于含3mlLB培养基的试管中，37℃、200r/min培养10h左右，然后按试管培养基量的2%转种1次，在相同条件下培养4h即成为活化种子。②工程菌三角摇瓶培养：取活化的种子，以2%接种量接种于含200ml2YT培养基的500ml摇瓶中，37℃、250r/min旋摇培养，当OD600值为1～2时可以作为5L发酵罐的菌种。③5L高密度发酵培养：发酵罐中的起始工作体积为2.5L，在罐中接入200ml三角摇瓶培养的种子(接种量为4%)。装料前校正pH和溶氧电极，发酵温度37℃，起始转速250rpm。发酵过程的几个关键参数为：A.溶氧量及转速：空气流速设定为每分钟1个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧量参数相关联，每30s提高或降低10r/min，溶解氧量控制在35%左右，最大转速达800r/min时通入纯氧；B.pH值：自动流加30%的氨水，使pH值保持在7.0左右；C.补料的流加：根据实际经验，用甘油代替葡萄糖作为碳源。补料的流加分两个阶段进行在5h的分批培养后，5～9h补加含5g甘油的补料；9～13h加入含100g甘油的补料。以上数据由微机自动收集和记录。整个发酵过程中,通过改变pH值、活化和诱导时间、溶解氧浓度和补料的流加，观察工程菌的生长和目的蛋白的表达。（3）菌体浓度、目的蛋白表达量、菌体总蛋白的测定①菌体浓度的分光光度测定波长为600nm；②使用灰度扫描仪测定电泳条带中目的蛋白含量③Bradford法测定菌体总蛋白要点提示：（1）发酵前应探索诱导外源基因高表达的最适条件，以使重组大肠杆菌既能高密度生长又能高效率表达外源目的蛋白。要实现外源基因的高表达而又不过多地影响宿主菌的生存，就必须优化诱导时期、诱导培养时间、诱导剂浓度等参数。（2）发酵的全过程中不加补料，则由于碳源和氮源的供给不足，而收菌量和表达量均很低；所以，应该根据基因重组菌的需求，将限制性底物(通常为碳源)不断流加到反应器中，可避免高浓度底物的抑制作用。限制性底物的流加速率决定了细胞的比生长速率，从而影响重组菌的稳定性及外源基因的表达。维持补料分批发酵中重组菌恒定的比生长速率，应采用指数流加的方式，也可采用阶梯式提高流加速率的方法。（3）高密度发酵中为了减少补料的稀释作用，通常采用高浓度补料液。这些浓液加入发酵液后，须立即混匀，否则细胞与局部的高浓度补料接触会造成代谢的失控。