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讲课部分内容（书上缺少的部分,缺图）张俊武三、部分重要的病毒基因组（一）M13噬菌体MM1133噬噬菌菌体体是是一一种种大大肠肠杆杆菌菌丝丝状状噬噬菌菌体体，，其其基基因因组组是是含含～～66440000nntt的的单单链链闭闭环环DDNNAA。。野野生生型型MM1133噬噬菌菌体体基基因因组组，，9900%%以以上上编编码码蛋蛋白白质质，，包包含含1100个个基基因因。。多多数数基基因因间间仅仅以以数数个个核核苷苷酸酸相相隔隔，，仅仅在在基基因因VVIIIIII和和IIIIII以以及及基基因因IIII和和IIVV之之间间有有较较长长的的核核苷苷酸酸相相隔隔。。这这些些基基因因间间隔隔区区含含有有调调节节基基因因表表达达和和病病毒毒DDNNAA合合成成的的元元件件。。MM1133噬噬菌菌体体最最大大的的优优点点是是：：在在用用做做克克隆隆载载体体时时可可产产生生仅仅含含外外源源DDNNAA某某一一条条链链的的DDNNAA分分子子。。这这种种单单链链DDNNAA分分子子可可在在以以下下工工作作中中作作为为模模板板：：11))双双脱脱氧氧链链终终止止法法DDNNAA测测序序22))制制备备仅仅有有一一条条链链得得到到放放射射性性标标记记的的DDNNAA探探针针33))利利用用寡寡核核苷苷酸酸进进行行定定点点突突变变（二）噬菌体噬菌体是最早使用的克隆载体之一，常用做构建基因组文库和cDNA文库。1．噬菌体的结构噬菌体基因组是长度约为50kb的双链DNA分子。在噬菌体颗粒内，其DNA为线状双链分子，两条链的5’端均有长12nt的互补单链（粘端，cos）。噬菌体的基因组包含50个基因，其调控较为复杂，且多数基因都行使各自必不可少的生理功能。其中一部分（主要为噬菌体基因组中间部位）为可置换部位，常用来插入外源基因。左臂部分主要包含编码组装噬菌体头部和尾部所需蛋白的基因，右臂部分包含与DNA复制相关的基因，这两部分不能替换。2．噬菌体的复制噬菌体线状DNA进入宿主细胞后，粘端相对，并在宿主细胞连接酶作用下缝合切口，形成闭合DNA分子。该DNA分子在感染早期充当转录模板。在此期间，噬菌体选择裂解或溶源两途径之一进行复制。（三）乙肝病毒（HepatitisBVirus,HBV）1．HBV基因组结构HBV的基因组结构奇特，是一环状的部分DNA双螺旋结构，长约3.2kb，其中2/3为双螺旋结构，1/3为单链。长链的5’端与3’端之间有300nt左右的缺口，与一种蛋白质形成共价连接。长链与短链的5’端以250～300nt互补。长链为负链（与病毒mRNA互补），短链为正链，短链的长度视个亚型而异，约为长链的50～90％（长约1.6～2.8kb）。短链之间的空隙可由病毒颗粒中的DNA聚合酶充填。HBV是目前已知的感染人类的最小的双链DNA病毒，但在很小的基因组中容纳了大量的遗传信息，因而HBV基因组结构显得特别精密浓缩，充分利用其遗传物质。①重叠的基因顺序较多HBV基因组中已确定的开放阅读框（ORF）有4个，分别编码病毒的核壳（C）蛋白、包膜（S）蛋白、病毒复制酶（聚合酶）及一种似乎与病毒基因组表达有关的蛋白质X。这些基因的顺序有些是重叠的。几年前新鉴别了ORF-5及ORF-6，均与X基因重叠，但功能尚不清楚。②调节序列位于基因内部如与HBV基因组复制相关的顺序有：短链顺向重复顺序DR1和DR2及U5样顺序（因与反转录病毒末端的U5序列类似而得名）。DR1与U5位于前C开放阅读框中，是合成DNA长链的起始部位。DR2位于聚合酶基因和X基因重叠处，是DNA短链合成的起始部位。与调节基因表达有关的顺序，如启动子，增强子，polyA添加信号，糖皮质激素受体结合敏感顺序（GRE），增强子结构，也都在编码蛋白质的基因顺序内。2.乙肝病毒的复制（四）反转录病毒反转录病毒颗粒内的基因组由两条相同的单链正义RNA组成，这使得反转录病毒为双倍体（这在病毒中是奇特的）。不同种类的反转录病毒RNA结构相似，但长度有变化，多在8～11kb之间。和真核生物mRNA一样，反转录病毒RNA5’端有帽子结构，3’端有poly(A)尾。基因组RNA的一部分与一个特异的宿主tRNA成碱基配对，此tRNA起始DNA的合成，这也是反转录病毒的一个奇特之处。（五）腺病毒（adenoviruses）人腺病毒DNA为双链线性DNA，全长36kb，其突出的结构特点是分子末端存在反转重复顺序。腺病毒DNA的两条链分别称为L链（轻链）或r链（右链）和H链（重链）或l链（左链），每条链的5’端都有蛋白与之结合。两条链可以分开并自己形成环状结构。二、质粒DNA许多微生物（包括细菌，酵母，真菌等）细胞中含有染色体外的双链环状DNA分子，称为质粒（plasmid）。这些质粒都是独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。然而，它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质进行复制和转录。在一般情况下，质粒对宿主细胞生存并不是必须的，但质粒的某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生存。如R质粒带有抗生素抗药基因，可使细菌耐受抗生素的作用；F质粒的变种F’质粒可携带一些宿主的基因，如Leu基因，当共转化Leu-细菌时，可使该细菌在缺乏Leu的培养基中生长。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性，产生抗生素，降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素，肠毒素及限制酶与修饰酶等。（一）质粒的分类1.按复制机理，可分为两类：①严格控制型质粒（stringentplasmid）这类质粒的复制受到宿主细胞的严格控制，在每个细胞中只含1或几个拷贝。②松弛控制型质粒（relaxedplasmid）这类质粒的复制不受宿主细胞的严格控制，每个细胞可含10～200个基因，而且当宿主细胞蛋白质合成受抑时，如在培养基中加入氯霉素，质粒拷贝数可继续增加，甚至可增至1000～3000。2.按质粒的功能，质粒可分为三类：①F质粒，即性质粒F质粒长94.5kb的双链闭环DNA分子，包括三个功能区域：转移区，插入区，复制区。F质粒可将宿主染色体基因转移到另一宿主细胞内。F质粒本身从F＋细胞转移到F–宿主细胞后，可使后者变成F+细菌。②R质粒，即抗药性质粒R质粒含抗药性基因，含有该质粒的细菌可产生对抗生素的抗药性。大多数R质粒由两部分DNA组成，一段称为抗性转移因子（Resistancetransferfactor,RTF）,另一部分为抗性决定因子（R-determinant）。③Col质粒该质粒含有大肠杆菌素(Colicin)的基因，可以杀死不含大肠杆菌素的亲缘细菌。另外，还有一些其它质粒，如Ent质粒，可以产生肠毒素，引起人类及动物的腹泻等。（二）质粒的一般性质1．绝大多数质粒都是环状超螺旋DNA分子，分子量范围很大，在106～108道尔顿之间（1～200kb以上）。酵母的杀伤质粒是一环状RNA分子。2．一个质粒所包含的基因都是单拷贝的。3．质粒可以转移许多质粒可以从供体细胞把它的一个复本转移给受体细胞。例如E.coli的F质粒可以从F+细胞转移到F－细胞，使后者变成F+,而前者也仍然保持F+。F质粒还可以把一个细胞的部分DNA带到另一宿主菌中。4．质粒具有不同的复制能力质粒DNA的复制要由负责复制细菌染色体DNA的多种酶群来完成，但是不同的质粒在宿主体内所使用的酶群不同，且在宿主中复制的程度也相差悬殊，因此，细菌细胞里所含质粒的拷贝数有高低之分。一些质粒不能以高拷贝存在于宿主细胞，是因为这些质粒可以编码阻遏蛋白，抑制本身DNA的复制。质粒拷贝数增加时，阻遏蛋白浓度增加，质粒复制受到抑制，只有当宿主细胞分裂后，阻遏蛋白被稀释，质粒DNA方能再进行复制。对于一些低拷贝数的质粒而言，在细胞分裂期间，随着随机的分割事件的发生，质粒有可能从某些细菌细胞中丢失。控制质粒拷贝数的基因出现在包括DNA复制起点在内的一个质粒DNA区域内。5．质粒的不相容性两种具有相同或顺序非常接近的复制子的质粒不能在子代细胞中稳定共存，当细胞分裂时会分别进入不同的子代细胞，这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。当两种质粒的复制子相同或具有很高的同源性时，可产生同样的阻遏蛋白，彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞。具有不同复制子的不同群质粒可能共存于同一菌体细胞内。如F质粒和ColE1质粒可以共存。人类基因组计划简介人人类类基基因因组组计计划划（（HHuummaannGGeennoommeePPrroojjeecctt,,HHGGPP））是是以以揭揭示示人人类类基基因因组组33××110099bbppDDNNAA序序列列并并识识别别其其中中几几万万个个基基因因为为目目标标的的计计划划。。此此计计划划于于11999900年年首首先先由由美美国国科科学学家家启启动动，，计计划划历历时时1155年年，，至至22000055年年完完成成，，但但现现在在实实际际上上已已有有世世界界多多国国科科学学家家卷卷入入。。其其内内容容可可概概括括为为完完成成四四个个图图。。11．．遗遗传传作作图图((ggeenneettiiccmmaappppiinngg))遗遗传传作作图图即即应应用用遗遗传传学学技技术术构构建建能能显显示示基基因因以以及及其其他他序序列列特特征征在在基基因因组组位位置置的的图图。。..遗遗传传学学技技术术包包括括[[系系谱谱((ppeeddiiggrreeee))]]杂杂交交育育种种实实验验，，对对人人类类则则是是检检查查家家族族史史。。最最初初使使用用基基因因作作标标记记，，现现又又增增补补了了DDNNAA多多态态性性的的遗遗传传标标记记。。第第一一代代DDNNAA遗遗传传标标记记是是RRFFLLPP((RReessttrriiccttiioonnFFrraaggmmeennttLLeennggtthhPPoollyymmoorrpphhiissmm,,限限制制性性内内切切酶酶片片段段长长度度多多态态性性))。。第第二二代代DDNNAA遗遗传传标标记记是是微微卫卫星星（（mmiiccrroossaatteelllleett））或或短短串串联联重重复复顺顺序序((SSTTRR,,SShhoorrttTTaannddeemmRReeppeeaattss或或SSTTRRPP,,SShhoorrttTTaannddeemmRReeppeeaattPPoollyymmoorrpphhiissmm或或SSSSLLPP,,SSiimmpplleeSSeeqquueenncceeLLeennggtthhPPoollyymmoorrpphhiissmm))。。法法国国与与美美国国的的几几个个中中心心合合作作，，至至11999966年年初初，，已已建建立立了了由由66000000多多个个SSTTRR为为主主体体的的遗遗传传标标记记所所组组成成的的““连连锁锁图图””，，平平均均分分辨辨率率（（两两个个标标记记之之间间的的平平均均距距离离））已已达达00..7755ccMM。。11999966年年，，美美国国MMIITT的的EE..llaannddeerr又又提提出出““第第三三代代DDNNAA遗遗传传标标记记””，，即即单单个个核核苷苷酸酸多多态态性性（（SSiinngglleeNNuucclleeoottiiddeePPoollyymmoorrpphhiissmm,,SSNNPP））。。2．物理作图（physicalmapping）是指应用分子生物学技术直接分析DNA分子，从而构建能显示包括基因在内的﹑序列特征的位置图。主要方法：限制酶作图（restrictionmapping）:它在DNA分子上定位限制性内切酶识别位点的相对位置。荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization,FISH）：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置。序列标记位点（sequencetaggedsite,STS）:通过对基因组片段进行PCR和（或）杂交分析，来对短序列进行定位作图。3．转录图转录图，或称cDNA图，即在基因