基因组学第7章.

第7章基因的转录调控原核生物与真核生物基因转录的差别原核生物与真核生物基因表达的方式有很大差别，主要表现在：1)原核生物基因的转录与mRNA的翻译偶联，转录与翻译同步进行，因此原核生物不存在mRNA的加工问题；2)真核生物基因的转录与mRNA的翻译在空间上是分开的，转录在细胞核中进行。转录的产物加工后输出到细胞质，由游离在胞质中或内质网上的核糖体将mRNA翻译成蛋白质。真核生物的转录初级产物要经过许多加工与修饰才能成为成熟的mRNA，未成熟的mRNA不能输出细胞核。大肠杆菌基因表达调控的方式大肠杆菌基因的转录起始控制有2种截然不同的方式：1)组成型调控--主要依赖于启动子的结构.2）调节型控制--主要依赖于调控蛋白的活性.由于原核生物的转录与翻译是偶联的,因此原核生物的转录可以通过翻译机制进行调控,如衰减调控.细菌转录起始调控的特点1)RNA多聚酶全酶包含与启动子互作的成分---西格玛因子和RNA多聚酶.转录起始后,RNA多聚酶脱离西格玛因子合成mRNA,西格玛因子仍然保留在启动子位置.2)启动子的专一性可由西格玛因子识别,它们之间的互作决定基因是否表达.3)启动子的组成决定了转录起始的基准水平.4)细菌转录调控元件(-35bp位置)的顺序比真核生物调控元件要长,可提高识别的专一性.大肠杆菌RNA多聚酶定点突变表明,-35位影响RNA聚合酶与DNA结合,称为识别域.-10位影响双链的解链,称为解旋域.启动子的结构规定了转录起始的基准水平大肠杆菌启动子-35盒和-10盒的一致顺序在不同的基序允许的范围内有很大的变化。这些变化与转录起始点周围以及下游50bp内的核苷酸顺序的组成共同影响启动子的工作效率，它们限定了单位时间内转录起始的次数，与RNA多聚酶离开启动子开始合成全长转录物直接相关。现在还不清楚启动子的顺序组成以何种方式来影响转录起始，但从一些比较分析的结果可推知：1）-35盒的组成主要影响σ亚基的识别以及RNA多聚酶附着的速率；2）-10盒的组成同转录起始复合物从封闭状态转向开放状态有关。大肠杆菌σ因子σ因子识别的启动子启动子一致顺序－35盒框－10盒框________________________________________σ70大多数基因TTGACATATAATσ32热激诱导基因TCTCNCCCTTGAACCCCATNTAσ28运动与趋化性基因CTAAACCGATATσ38稳定期表达基因？？－24盒框－12盒框σ54氮代谢与其它功能CTGGNATTGCA大肠杆菌的转录终止细菌采用2种不同的转录终止策略。大肠杆菌中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串腺嘌呤苷核酸，称为内终止子（intrinsicterminator），形成终止信号。内终止子指令的转录物与模板的结合很不稳定，可促使多聚酶离开DNA。原因有二：其一，反向回文序列被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互作；其二，由于在茎环3'端紧接一串A/U的配对，稳定性较差，有利于转录终止而不利于转录延续。第二种终止信号是Rho，这种终止策略称为Rho依赖型（Rhodependent）。Rho信号顺序可形成发夹结构，但不太稳定，其后也缺少一串腺嘌呤，尚需借助另一称为Rho蛋白的帮助促使转录终止。转录起始后Rho蛋白即附着于转录物并沿新生的RNA分子向多聚酶方向移动。如果多聚酶一直合成RNA，因其前进速度较快跑在Rho蛋白的前面，不会出现转录终止。倘若多聚酶遇上终止信号，由于发夹结构的形成使多聚酶被迫暂时停止，此时Rho蛋白正好赶上。Rho蛋白是一个解旋酶，它可使RNA与DNA之间的配对碱基分开，导致多聚酶离开模板。大肠杆菌基因转录终止调控抗终止与衰减调控1）第一种机制称为抗终止（antitermination）。当RNA多聚酶遇到终止信号时可无视其存在继续前进，直至第二个终止信号出现。这种情况常常出现在第一个终止信号的下游仍有一个或数个基因，它们与前面的基因共享同一启动子时。当多聚酶在第一个终止信号处停止时，其后的基因不表达；若多聚酶不理睬第一个终止子继续前进，其下游的基因则可表达。多聚酶本身不能作出是否停止的决定，需要借助一个抗终子蛋白（antiterminationprotein）。2）第二种控制终止的类型为衰减（attenuation），主要涉及氨基酸如色氨酸合成有关的操纵子。色氨酸操纵子启动子下游有一段140bp的引导顺序，终止信号位于+100～+140bp之间，可形成发夹结构，但取决于RNA多聚酶与核糖体之间的相对位置。引导顺序+50～+60bp有两个色氨酸密码子，当细胞中色氨酸水平很低时，核糖体会在这儿停留，拉开与RNA多聚酶间的距离，阻止终止信号形成发夹结构，转录正常进行。当细胞中有足够的色氨酸存在时，核糖体紧跟RNA聚合酶，在转录到达近+140bp位置时，终止信号形成发夹结构，RNA多聚酶脱离模板，转录停止。其它一些氨基酸，如组氨酸，亮氨酸和苏氨酸的生物合成也采取衰减控制模式。3）衰减调控仅出现在细菌中，它要求转录与翻译同步进行。此外，转录与翻译的速度必须大体一致，如果转录太快，或翻译太慢都无法协调衰减控制必需的几种因素之间的互作。抗终止机理转录衰减调控大肠杆菌转录的速率为40nt/s,翻译的速率为15aa/s,两者速度大致相同.如果一个太快或者一个太慢,就不易利用衰减调控.在色氨酸丰余时,核糖体翻译快速通过1区和2区,导致1和2区,3和4区互配形成双链.核糖体到达3和4区时受阻,由于4区后的一连串-UUUUU-,促使mRNA脱离模版DNA,翻译停止.在色氨酸不足时,核糖体缓慢通过1区,导致2和3区形成茎环结构,不影响翻译.原核生物基因的正调控与负调控1)负调控:调节蛋白质与顺式元件(调控顺序)结合阻止或抑制基因转录的调控方式,如乳糖操纵子表达调控.2)正调控:调节蛋白质与顺式元件(调控顺序)结合增强或激活基因转录的调控方式,如CAP-cAMP复合物调控非葡萄糖碳源的利用.真核生物基因表达调控的层次DA:远端启动子区(promoter-distal).PA:近端启动子区(promoterproximal).TATA:TATA盒.INR:起始顺序(Initiator).DPE:下游启动子区(downstream-Promoterelement).真核生物基因表达调控的特征1)大范围与小范围调控:染色体水平,如X-染色体的随机失活,可逆异染色质状态涉及大面积的基因表达调控.2)可逆调控与不可逆调控:与发育相关的基因具有不可逆的调控,外界诱导表达的基因多为可逆调控.3)有和无调控:“开”与“关”属于有和无的调控.4)粗与细调控:表达产物的多少属于粗调,表达产物的加工,修饰和半衰期属于细调.真核生物转录起始调控的特点1)多层次调控:染色质水平,核小体水平,DNA甲基化水平,启动子水平等.2)真核生物RNA多聚酶不直接与启动子接触.普遍性转录因子与启动子互作,构建RNA多聚酶结合的平台.3)普遍性转录因子与启动子互作受控于增强子.4)增强子在基因转录起始调控中起关键作用,增强子由许多调控元件组合而成,有不同的组合调控方式,是基因差别表达的结构基.真核生物三种RNA多聚酶及基因分类—————————————————————-----------RNA多聚酶I28S,5.8S,18S核糖体RNA基因RNA多聚酶II蛋白质编码基因，小分子细胞核RNA（snRNA，URNA）基因RNA多聚酶III转运RNA（tRNA），5S核糖体RNAU6-snRNA，小分子核仁R（snoRNA）小分子细胞质RNA（scRNA）基因————————————————————--------------1)三种RNA多聚酶的命名系根据这三种酶在层析柱上洗脱时出现的先后秩序依次命名.2)根据基因转录时采用的RNA多聚酶类型分别将基因分为PolI基因,PolII基因,PolIII基因.POLI基因-rRNA基因的结构t2和t3:转录终止信号.真核生物rRNA基因的组成1)真核生物PolI基因只有一种类型，即核糖体RNA基因（rRNA基因）。2)真核生物rRNA基因含3个成员，即18s，5.8和28srRNA基因共同组成一个表达单位。3)所有真核生物rRNA基因均为多拷贝，彼此首尾串联，簇集在染色体的特定区域。POLI基因的结构特征每个rRNA基因重复单位包括以下几个组成部分：1）与rRNA结构基因相邻的一段非转录间区(nontranscribedspacer,NTS)；2）编码区5‘端及3’端的外间区（externaltranscribedspacer，ETS）；3）编码区之间的内间区(internaltranscribedspacer，ITS)4）rRNA基因编码区在基因转录时，内间区(ITS)和编码区和外间区(ETS)一起转录成前体rRNA（prerRNA），ITS和ETS随后被依次切除。rRNA基因启动子剖析DNA足迹法检测rRNA基因调控顺序位点DNA足迹法DNAasefootprintingasimplemethodforthedetectionofprotein-DNAbindingspecificity:ThetechniqueisasimpleconjoiningoftheMaxam-GilbertDNA-sequencingmethodandthetechniqueofDNAase-protectedfragmentisolation.1)Fragmentsofa5'end-labelled,double-strandedDNAsegment,2)partiallydegradedbyDNAaseinthepresenceandabsenceofthebindingprotein,3)visualizedbyeletrophoresisandautoradiographyalongsidethebase-specificreactionproductsoftheMaxam-Gilbertsequencingmethod.ItisthenpossibletoseetheprotectivefootprintofthebindingproteinontheDNAsequence.调控顺序种间专一性人类和小鼠rRNA基因的UCE和Core区具有很强的种属专一性.POLI基因的调控顺序真核生物细胞核rDNA转录区在各物种间显示很强的保守性，而非转录区与内间区在长度与顺序组成上则表现很大的变异。非转录区是rDNA中变化最大，也是十分重要的一个区域。非转录区有以下三个特点：1）含有启动子，控制rRNA基因的转录；2）很多小段的重复序列，又称亚重复子（subrepeat），具有增强子功能；3）存在与rRNA基因的转录终止有关的信号。4）rRNA基因的调控顺序有一突出特点，即表现高度的种属专一性。不同种属的rRNA基因缺少普遍适用的保守的启动子顺序。rRNA基因转录控制上游结合因子UBF含HMG盒,可插入DNA小沟.两个UBF因子与上上游调控顺序结合将DNA链弯曲约30度,再征招TIT-IB复合物.核仁显性的分子机制位与增强子区的重复顺序单元数目是决定爪蟾种间rRNA基因显性表达的控制元件.POLII基因1）蛋白质基因2）URNA基因或sn/snoRNA基因高等真核生物蛋白质编码基因表达调控研究的策略与方法1)高等真核生物基因表达调控的研究方法与原核生物有很大的不同.因为高等真核生物基因位于染色体中,在细胞核内转录,很难获得大量的转录产物供实验研究.2)高等真核生物基因的表达调控必须在真核细胞的背境下研究才能获得和体内表达调控相似的结果.原核生物有质粒这样的克隆表达载体,而高等真核生物缺少类似的系统.3)因此高等真核生物基因表达调控的研究首先必须寻找和建立有效的研究体系,它们具有可以进行体外重组DNA操作,又可在真核生物细胞内部进行表达研究.4)早期的高等真核生物基因表达研究是从动物病毒入手,因为