基因诊断与测序技术在其中的应用_陈然_2015-03-20

基因诊断与测序技术在其中的应用武汉分子生物学实验室陈然2015-03-20KGDiagnosticsConfidential内容基因诊断的概念基因测序技术及发展沿革一代测序及片段分析检测流程二代测序技术流程测序结果的分类及测序策略的选择测序技术的局限性KGDiagnosticsConfidential基因诊断的概念内容-1KGDiagnosticsConfidential基因诊断≠基因预测基因检测基因预测基因诊断即分子诊断，应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化等而做出的或辅助临床诊断的技术。又称基因体检，通过检测基因判断未来患某种疾病的可能性（风险预测），进而加强健康管理。基因诊断≠基因治疗基因诊断的概念KGDiagnosticsConfidential正常人不会发生融合基因或基因突变。某些疾病的患者会检测出融合基因或基因突变。两个或多个基因的编码区相连接，表达融合蛋白。可由染色体易位造成，常与染色体项目、流式项目同时送检。项目：BCR/ABL,AML1/ETO,PML/RARa,AML16种筛查，ALL15种筛查，31种筛查……技术：定性PCR、定量PCR、基因芯片、二代测序。融合基因基因在结构上发生的碱基对或排列顺序的改变，包括点突变、插入/缺失突变（INDEL）。项目：JAK2V617F,CALRExon9,AML预后,EGFR,Kras,HLH,Fanconi,地贫DMD,HBV耐药……技术：定量PCR、基因芯片、一代测序、二代测序、MLPA、定性PCR、杂交。基因突变分子实验室开展的诊断类检测-1KGDiagnosticsConfidential正常人和某些疾病的患者间基因表达量不同。用分子生物学手段检测个体基因型（Genotype）。项目：配型,嵌合率,HCV分型，SNP，亲子鉴定……技术：一代测序、片段分析、二代测序、基因芯片。基因分型量化检测mRNA的多少。项目：化疗ERCC1，RRM1，TUBB3，TYMS基因mRNA表达含量……技术：定量PCR、二代测序。基因表达正常人之间的基因分型不同。分子实验室开展的诊断类检测-2KGDiagnosticsConfidential基因测序技术及发展沿革内容-2KGDiagnosticsConfidentialDNA测序技术，即基因测序技术，是指测定DNA碱基序列的技术。人类基因组约有30亿个碱基对。大部分DNA测序的目的是得到特定基因的特定区域上序列信息——A、T、G、C四种碱基的排列顺序，即靶向基因测序/目标区域测序。通过对比被检者的碱基排列顺序是否与正常人一致，以此作为疾病诊断的依据。测序技术已广泛应用在医学、生物学研究，各类疾病的检测和筛查，物种鉴定，农作物筛选，基因工程……基因测序技术KGDiagnosticsConfidential为什么使用测序技术进行诊断既能检测已知突变、也能检测未知突变。二代测序技术的发展使得基因诊断的深度和广度得到极大扩展，使得多基因参与的复杂疾病检测，及高灵敏度检测成为可能。能够检测一段区域内的所有点突变。——具备成本和可操作性上的优势。KGDiagnosticsConfidentialThermoLife/ABI3500xLBeckmanCoulterGenomeLabGeXPRoche/454GenomeSequenserFLXIllunimaHiSeq2500Life/IonTorrentPGMPacBioRSSystem一代测序二代测序三代测序1977起2005起2011起ThermoLife/ABISolid5500测序技术的发展KGDiagnosticsConfidential一代测序二代测序(NGS)三代测序(3GS)技术原理双脱氧末端终止法（Sanger法）+毛细管电泳（CE）；Roche454：高通量焦磷酸测序；Illumina：桥接PCR+边合成边测序；ABISolid：寡聚物连接检测测序；IonTorrent：H+电位信号检测+半导体芯片；——大规模平行测序（massivelyparallelDNAsequencing），生物信息技术处理产出数据；单分子实时测序；特点高读长；检测通量中等；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序；检测通量高；检测灵敏度高；开机运行成本高，但平摊到每样本、每碱基的成本低；适用于多基因，多位点的测序；可自动完成数据分析；高读长，特别适合于denovo测序；检测通量高；准确性低（81-83%）；开机运行成本很高；应用范围研究和临床检测；研究和临床检测；目前只用于研究；三代测序技术的比较KGDiagnosticsConfidential一代测序及片段分析检测流程内容-3KGDiagnosticsConfidential样本收取&处理PCR扩增目的片段酶解消化测序反应（双脱氧末端终止法）测序反应产物纯化（乙醇沉淀）加入Hi-Di甲酰胺，变性基因分析仪上机（毛细管电泳）分析结果，得出报告一代测序检测流程KGDiagnosticsConfidential医院前处理录入Lis系统分子实验室分拣、登记物流标本（血液）DNARNA提取核酸过程标本收取&处理KGDiagnosticsConfidentialPCR：PolymeraseChainReaction（聚合酶链式反应）的简称。PCR是一个在体外特异性的复制一段DNA片段的过程。1985年由美国科学家Mullis发明。分子生物学最常用的体外扩增DNA的方法，使人们很快的获得大量拷贝的特异DNA片段，利于继续进行后续检测的分析。DNA模板；4种脱氧单核苷酸dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）；耐热性聚合酶(如Taq)；一对特异性引物；适量的反应缓冲液；基因扩增仪（PCR仪）PCR扩展目的基因片段KGDiagnosticsConfidential时间温度延伸3变性1退火21个PCR循环包括变性、退火、延伸3步重复1~3步30-35轮目的DNA片段扩增百万至亿倍以上，能够被电泳等后续方法检测到。DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR程序KGDiagnosticsConfidential模板DNA95℃KGDiagnosticsConfidentialPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点56℃引物1引物2DNA引物KGDiagnosticsConfidentialPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃引物1引物2DNA引物TaqTaqdATPdGTPdTTPdCTPKGDiagnosticsConfidentialPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃第1轮循环结束第2轮循环开始KGDiagnosticsConfidentialPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点TaqTaqTaqTaqdATPdGTPdTTPdCTP56℃72℃95℃KGDiagnosticsConfidentialPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮循环结束第3轮、第4轮……KGDiagnosticsConfidentialNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824经多次循环后靶片段扩增的数量KGDiagnosticsConfidentialSAP：ShrimpAlkalinePhosphatase，虾碱性磷酸酶，催化降解体系里多余的dNTP。ExoI：ExonucleaseI，核酸外切酶I，催化分解体系里多余的单链DNA（即引物）。同时向PCR产物中加入一定的SAP和ExoI，去除多余的dNTP和引物，只保留扩增产物，达到纯化的效果。酶解消化KGDiagnosticsConfidentialFrederickSanger,1918-2013。1958年和1980年诺贝尔化学奖得主。1977年提出双脱氧末端终止法。在反应体系中加入已经过酶解消化的PCR产物、耐热性聚合酶、4种脱氧单核苷酸dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、4种带荧光标记的双脱氧单核苷酸ddNTP（包括ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）、单条特异性引物、适量的缓冲液。测序反应：双脱氧末端终止法（Sanger法）KGDiagnosticsConfidential#由于双脱氧单核苷酸缺乏延伸所需要的3-OH基团，一旦掺入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。#每当DNA聚合酶需要dNTP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是掺入ddNTP，结果导致DNA链延长的终止；二是掺入dNTP，使DNA链仍可继续延长，直至掺入下一个ddNTP。#根据这一方法，就可得到一组长短不一的链终止产物，彼此只相差一个碱基。它们有共同的起始点，但终止在不同的荧光标记的ddNTP上。#通过高分辨电泳对这一组产物进行分离，光学系统捕捉到ddNTP的荧光信号，以峰的形式展现成图谱，并按顺序排列。从电泳图谱上可读得DNA碱基序列。测序反应：双脱氧末端终止法（Sanger法）-2KGDiagnosticsConfidential测序反应产物纯化目的：去除多余荧光ddNTP对激光检测器的干扰；方法：乙醇沉淀法。加入Hi-Di甲酰胺并变性：将DNA双链打开，维持其处于单链状态。测序反应产物纯化及变性KGDiagnosticsConfidential基因分析仪工作原理毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis，CE）：以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳的分辨率比PAGE电泳更高，能够分辨出1个碱基的DNA片段差异。经双脱氧末端终止法扩增出来的以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段通过毛细管电泳分离，再经激光系统对ddNTP上的荧光信号检测，就能得到DNA的序列信息。基因分析仪上机KGDiagnosticsConfidential参考序列样本序列报出与参考序列不一致的地方测序结果分析KGDiagnosticsConfidential毛细管电泳分离Sanger法测序产物——一代测序分离PCR产物——片段分析片段分析（FragmentAnalysis）：用带荧光标记的引物扩增目的DNA片段（可实现多重扩增），产物经毛细管电泳分离后得到荧光峰图谱，再经软件处理得出产物的片段大小，从而得到基因型等结果。基因分析仪——不仅仅用于测序KGDiagnosticsConfidential测序：检测DNA片段中的碱基序列。片段分析：分离荧光标记的片段并检测其大小。流程短；灵敏度高；多重扩增增加了检测通量；应用及衍生技术多；不能检测点突变，不能检测未知突变。测序vs片段分析KGDiagnosticsConfidential片段分析SNP分型—SNaPshot—SNaPlex微卫星/STR—基因连锁定位—动物育种—人身份鉴定—微卫星不稳定性—嵌合体相对荧光定量—MLPA—LOH—QF-PCR/QMPSF指纹图谱分析—AFLP片段分析的应用KGDiagnosticsConfidential样本收取&处理PCR扩增目的片段上样准备基因分析仪上机（毛细管电泳）分析结果，得出报告片段分析的检测流程KGDiagnosticsConfidentialPCR：引物带有荧光标记，故扩增出的PCR产物也带有荧光标记。上样准备：PCR产物+Hi-Di甲酰胺+内标，变性。基因分析仪上机：进行毛细管电泳，光学系统捕捉到荧光信号，并以峰的形式展现成图谱。PCR→上样准备→上机KGDiagnosticsConfidential片段结果示例KGDiagnosticsConfidentialMLPA：MultiplexLigation-dependentProbeAmplification（多