生防真菌固体发酵

生防菌固体发酵及菌剂研制-以盾壳霉为例昆虫生防真菌的工业发酵方法我国的双向发酵生产分生孢子工艺尚未形成知名产品气垫式生产分生孢子（前捷克斯洛伐克）Itaforte公司UsinaUnivalem公司SaoMartinho公司绿僵菌生产车间固相三级扩大发酵我国上世纪70年代的固相三级扩大发酵前人研究固体发酵优点类似于真菌的自然生活方式有利于产物的获得和干燥。抗紫外线以及抗干燥能力存活期长前人研究盾壳霉固体发酵的例证大麻秸秆＋外源营养9×1014个盾壳霉分生孢子/立方米燕麦6×1014个分生孢子/立方米前人研究真菌制剂剂型可湿性粉剂、油剂、悬浮剂质量比油剂和悬浮剂易控制可湿性粉剂制造成本较低效果稳定盾壳霉简介盾壳霉制剂研究国家商品名称防治对象俄罗斯Coniothyrin向日葵菌核病德国、瑞士Contans®大田作物菌核病匈亚利KONI温室及园艺作物菌核病本项研究的目的探讨利用废弃的油菜秸秆培养盾壳霉的可行性制备盾壳霉可湿性粉剂检验盾壳霉的防病效果油菜收获后，秸秆背废弃在田间地头固体发酵方法烘干的油菜秸秆粉碎（2cm)，在500ml三角瓶加不同的营养成分及水份，浸泡12h后灭菌。接种盾壳霉分生孢子悬浮液，20℃培养15d，水洗、离心得分生孢子研究内容油菜秸秆培养盾壳霉的条件优化以产孢量、孢子萌发率、存活性为指标筛选菌株确定基质含水量确定接种量确定外源营养物质的确定发酵周期研究内容分生孢子菌剂的制备及存活期的测定可湿性粉剂的制备表面活性剂、载体、粘着剂、孢子萌发促进剂、紫外线保护剂的筛选制剂存活期的测定菌剂的防病效果评价技术路线发酵配方筛选分生孢子的提取和干燥菌剂制备加工检测药效试验和储存试验不同菌株产孢量测定0100200300400Chy-1ZS-1Sv-5-2Sv-10-1V-250-1菌株孢子产量（107个/克干基质）AAABC水分对产孢量的影响（每10g干料）02468304050606570水份含量（g)产量（×108个孢子/克基质）AAAABB接种量不同对产孢量的影响接种量（×10⁶/瓶）孢子产量（×10⁸/克）54.45a263.39a522.81a1302.73a2602.75aP0.05发酵周期的确定不同培养时间的分生孢子产量04812160d6d9d12d16d19d培养天数孢子个数(×109)CBAAAD不同培养时间得到的孢子萌发率差异发酵天数24h萌发率48h萌发率6d86.2A90.2A9d85.9A91.3A12d85.3A92.5A16d70.5B92.1A19d71.5B91.6AP0.01外加C源对分生孢子产量的影响0306090120150可溶性淀粉麦芽糖蔗糖葡萄糖乳糖对照产量（107个/g干基质）aaaaba小结不同菌株产孢量不同。菌株Chy-1产孢量、48h孢子萌发率最高；水浴处理及紫外线处理的孢子活率较其他菌株好水分对孢子产量的影响，以1:3-1:6产量无差别，大于1:6.5孢子产量下降；以1:3-1:5水浴处理活孢率最高发酵周期以12d为宜接种量对孢子产量影响不大可溶性淀粉、葡萄糖是较好的外加C源；外加N源以酵母粉最好油菜秸秆发酵的改进（王爱琴的研究）粉碎秸秆+添加麸皮及玉米粉在耐高温塑料袋中发酵将来还要过度到敞开发酵√最后，研究了以油菜秸秆为主要原料培养盾壳霉分生孢子的技术油菜收获后秸秆被废弃，或作为煮饭的燃料烧掉秸秆中的营养可以满足盾壳霉产生分生孢子的需要将秸秆粉碎，添加少量玉米粉和麸皮，即可培养盾壳霉。产量达到109分生孢子/g发酵前发酵后培养料的优势：价廉、通气性好（不板结）菌剂制备试验方案提取和干燥孢子筛选菌剂添加物混合和粉碎菌剂分析菌剂质量活孢子数、水分、悬浮率、润湿时间测定菌剂有效存活期研究内容可湿性粉剂的成分表面活性剂紫外线保护剂粘着剂孢子萌发促进剂（微量元素增效剂）载体表面活性剂的筛选考查指标与盾壳霉的相容性对盾壳霉分生孢子萌发的影响对盾壳霉菌丝生长速率的影响润湿分散性表面活性剂的筛选结果（分散剂）表面活性剂浓度（ppm）孢子萌发菌丝生长木质素磺酸钙1252505001000+++++-+++++++木质素磺酸钠1252505001000++++++++++拉开粉1252505001000+++-++--NNO1252505001000----++++表面活性剂的筛选结果（润湿剂）湿润剂浓度（ppm）孢子萌发菌丝生长十二烷基磺酸钠2550100200+++-++--十二烷基硫酸钠2550100200++------分散剂分散力的测定浓度(%)处理时间(h)分散剂木质素磺酸钙木质素磺酸钠对照0.012500.930.831.0911.091.041.1941.121.081.130.025000.450.251.0910.510.301.1940.630.561.130.050000.370.211.0910.460.191.1940.580.281.13润湿剂润湿性的测定结果浓度（％）重复润湿时间（秒）0.01240224732530.51108211331051.01932873952.011002943105载体的筛选考查指标（参照王成树等）与盾壳霉的相容性对盾壳霉分生孢子萌发的影响对盾壳霉菌丝生长速率的影响对盾壳霉分生孢子存活的影响载体的筛选结果（孢子萌发）载体种类浓度（％）孢子萌发率（％）凹凸棒土549.6a高岭土547.6a对照046.8a膨润土546.8a硅藻土546.0a珍珠岩544.8a陶土544.1a碳酸钙543.6a白碳黑50.0b载体的筛选结果（菌丝生长速率)载体种类浓度（％）菌丝生长速度（mm/d）硅藻土53.28a陶土53.24a高岭土53.20abCK03.10ab凹凸棒土52.96bc珍珠岩52.52cd碳酸钙52.40de膨润土52.06f白碳黑50.00g不同载体对盾壳霉水浴活率的影响020406080100硅藻土高岭土陶土凹凸棒土对照水浴活率（％）AABBC微量元素增效剂的筛选种类：硼酸、蔗糖、硫酸锌、氯化钙、氯化钾、硫酸镁评价指标：稀释5、10、50、100ppm,在WA培养基上，24h、36h别看其对盾壳霉分生孢子的萌发率的差异微量元素增效剂的筛选结果处理浓度(ppm)孢子萌发率（24h,％）孢子萌发率（48h,％）硫酸锌565.2BC74.7a1072.5AB74.2a5073.4A75.7a10078.0A77.4aCK58.7C73.2aP0.05或0.01紫外线保护剂的筛选种类：荧光素钠（YG)、核黄素（VB2)、抗坏血酸（VC）评价指标：对盾壳霉分生孢子萌发的影响保护效果的验证（参照应盛华等《白僵菌乳悬剂的配方筛选》）盾壳霉分生孢子对紫外线的敏感测定0204060801000306090120300照射时间(s)死亡率(%)紫外线保护剂的筛选结果(保护效果)处理浓度（％）保护效能指数荧光素钠0.05－0.19I0.10－0.12H0.20－0.09G抗坏血酸0.050.47C0.101.12B0.201.14A核黄素0.050.02F0.100.06E0.200.15D粘着剂的筛选种类：黄原胶、羧甲基纤维素钠、蔗糖、可溶性淀粉步骤：0.05％的粘着剂母液＋盾壳霉孢子悬浮液分别对油菜花瓣和叶片喷雾，4h后取同一高度的花瓣（30朵）和叶片（6片，打孔取30片）在100ml无菌水中研磨，稀释后涂选择性培养基（农利灵＋青霉素＋链霉素）4天后调查孢子的萌发。粘着剂的筛选结果0102030405060黄原胶可溶性淀粉羧甲基纤维素钠蔗糖对照菌落形成单位(个/皿)花瓣叶片AABAABCBAB小结盾壳霉可湿性粉剂配方有效成份分生孢子数(108/g)十二烷基苯磺酸钠(1-1.5%)木质素磺酸钙或钠(5-10%)黄原胶(1%)孢子萌发促进剂(0.1%)抗坏血酸(10%)硅藻土（补100%）盾壳霉可湿性粉剂样品