微生物色素的研究进展

微生物色素的研究进展摘要：天然色素天然色素与人工合成色素相比有无毒、安全性高、色泽自然鲜艳、并有很高的营养价值和药理功能等优越性,日益受到重视和青睐。而利用微生物资源生产天然色素,克服以动植物为原料生产天然色素的诸多缺点,并且易于工业化。因此,采用微生物生产天然色素将逐渐成为天然色素来源的主流。本文介绍了几种微生物色素以及他们的提取和应用。关键词：微生物色素;色素种类，应用19世纪中期以前,人们应用比较粗制的天然色素作为主要的色素。1856年,Perkins等首次合成了苯胺紫,随着科技的进步和工业的发展,合成色素迅速取代了天然色素在食品中的地位。但随着毒理学的发展,人们意识到合成色素不仅无任何营养价值,而且污染大,毒副作用严重。因此,开发更为安全高效的色素生产技术成为亟待解决的难点之一。微生物能产生种类繁多的天然色素,通过微生物发酵生产色素不受资源、环境和空间的限制,是一种有效的天然色素生产途径。国内外对微生物天然色素的生产进行了大量研究,但主要集中于高产菌株的选育、培养条件的优化和产物的提取等方面。由于传统的微生物发酵法制备色素存在所得色素价格较低、提纯工艺复杂及成本高等不足,因此,从分子水平阐释色素生物合成途径,分离色素合成关键酶基因,通过基因工程技术来改变微生物色素的组成和含量,构建色素高产工程菌将是未来微生物色素生产和发展的主要方向。本文概述了微生物色素的生物合成和遗传工程的研究进展,为微生物色素的大规模生产提供参考。微生物色素是一种次生代谢产物，一般是在菌体生长后期开始合成，其合成过程可能是在培养基中缺乏某种营养物质，菌体的生长过程受到限制时被启动的。一般是菌体生长繁殖过程中不需要的物质、菌体失去合成这种物质的能力后照常生长。1天然色素的提取方法天然色素的主要提取方法有有机溶剂提取法，碱提取法，超临界CO2萃取法，微波萃取法等。以下是几种常见提取方法的简单介绍。1.1有机溶剂提取法有机溶剂提取法是目前微生物色素提取最常用的方法。常用溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、石油醚等。相对而言，有机溶剂提取法萃取剂便宜，设备简单，操作步骤简单易行，提取率较高，但用其提取的某些产品的质量较差，纯度较低，有异味或溶剂残留，影响产品的应用范围。1.1碱提法碱提法主要是应用了碱对多种生物物质的影响作用。其提取效率虽不如有机溶剂提取率高，但从经济角度和安全性考虑仍有应用价值。由于碱提法加工过程需消耗大量酸碱，且废液较难回收，因此近几年来对碱提法的研究报道也较少。1.2超临界CO2流体萃取法超临界二氧化碳流体萃取是近一二十年发展起来的一种新型物质分离、精制技术。它兼备有气体低粘度、高扩散和流体的高密度、大溶解度两方面的特点。由于超临界CO2提取工艺简单，能耗低，萃取剂便宜，提取的产品具有纯度高、溶剂残留少，无毒副作用等优点，越来越受到人们的重视。超临界CO流体萃取技术是一种新型的绿色分离技术，但因为存在技术尚不完善、设备复杂且昂贵、运行成本高等问题，使这种萃取方法在该领域的发展和应用受到了一定的限制。1.3微波萃取法微波萃取是在密闭容器中用微波加热样品及有机溶剂，将待测物质组分从样品基体中提取出来的一种方法，是由密闭容器中酸硝解样品和液固萃取有机物两种技术相结合演变出来的。其能在短时间内完成多种样品组分的萃取，溶剂用量少，结果重现性好II。微波萃取克服了超临界萃取和溶剂萃取方法的上述的缺陷，既降低了操作费用，又符合环境保护的要求，表现出良好的发展前景和巨大的应用潜力。微波萃取天然色素技术在实验工作中虽然已经取得一定重要成果，但由于受它的特性的限制，应用范围受到了一定的影响。如果利用微波的促进传质作用，来克服传统浸提中存在的传质障碍，则可大大提高生产效率。目前此项工作正受许多科研工作者的重视，多项研究成果显示出微波萃取这一方法的优越性，开展微波萃取技术在天然色素提取上的应用研究具有广阔的前景。2几种主要的微生物色素微生物色素有很多种类，主要有红曲色素，β-类胡萝卜素，黑色素，靛蓝和醌类色素等，下面就这几种主要的微生物色素做个简单的介绍。2.1红曲色素红曲色素是属于聚酮类色素，是红曲霉在生长过程中产生的一系列色素的总称，它是世界上目前唯一一种用微生物发酵生产的食用色素。红曲色素在红曲霉所产生的代谢产物中研究最早、研究最多，长期以来作为食品着色剂使用。2.1.1红曲色素的种类红曲色素已被确定出化学结构且广为人知的有6种，可分为3类，即红色素Monascorubramine与Rubropunctamine、橙色素Monascorubin与Rubropunctatin及黄色素Ankaflavin与Monascin，它们是属于Azaphilones类的真菌代谢物，构造极为类似。2.1.2红曲色素的特点(1)对碱稳定：当酸碱度极度上升时，它的水溶液颜色才会发生变色，乙醇溶液在酸碱度pH11时仍保持稳定的红色。(2)耐热性好：在一般的加工温度下其颜色不会发生明显变化。在酸碱度为中性范围内加热时也比较稳定。(3)耐光性好:红曲色素对日常光线是比较稳定的，乙醇溶液对紫外线相当稳定。在太阳光强烈直射下则色泽减弱。2.1.3红曲色素的应用红曲色素由于具有许多天然色素的优点，在食品加工业中具有广泛的应用。主要应用于肉制品、面制品以及饮料和调味料的着色。2.1.4红曲色素的生产工艺红曲色素的生产工艺主要有传统固－固发酵，液态发酵（液－液发酵）和液固发酵（液－固发酵）。传统固－固发酵，传统工艺适合小型或家庭作坊式生产红曲。其主要特点是地面培养红曲，工具设备简陋，现在仍应用于小红曲厂家或农村家庭副业红曲制造。其生产工艺流程如下：液态发酵（液－液发酵），此法主要用于生产水溶性的红曲红色素，在我国有十多年的历史。其主要特点是从种子培养到制曲都处于液体环境，生产的色素发酵期短，色价高，水溶性好，产品收得率也较高。其生产工艺流程如下：平板与斜面培养（7－8天）→种子液培养（24－26小时）→一级种子罐培养（7－8小时）→二级种子罐培养（7－8小时）→发酵罐发酵（70－75小时）→板框压滤浸泡滤渣（用70％－80％酒精浸泡搅拌约28－36小时）→再次压滤真空浓缩（回收酒精）→喷雾干燥成粉状红曲红→成品包装。液固发酵（液－固发酵），先用种子罐液体培养种子，代替固体种曲接种，后用固体培养发酵，简称液─固法，适用于产量大的红曲厂。它与传统工艺生产不同的是：纯种培养制种；提高发酵厚度（占地面积少，节省厂房）；采用通风措施和自控设备装置来控制培养品温；利用烘干设备进行成品干燥等。同时，产品质量比较稳定。这种液体种子培养法有利于实现机械化，缩短种子培养时间，质量好，生长繁殖速度快等，提高了红曲质量，同时有利于科学管理。2.2β-类胡萝卜素β-胡萝卜素属于多稀色素，是多种胡萝卜素中的一种，是维生素A的前体，也称维生素原，它的稀溶液呈橙黄色至黄色。β-胡萝卜素广泛存在于植物、藻类和真菌中，但动物和人体内不能合成胡萝卜素，必须从外界摄取。2.2.1β-类胡萝卜素的应用β-类胡萝卜素是重要的食品添加剂和食品强化剂，广泛用作黄色着色剂以代替油溶性焦油系着色剂。在果汁中与维生素C合用，可提高稳定性。另外β-类胡萝卜素在医学领域和化妆品领域也有广泛的应用。2.3黑色素黑色素是广泛存在于动物、植物和微生物中的棕黑到黑色的色素。这种色素虽然对于生物的生长、发育不是必不可少的，但却能提高生物生存、竞争的能力。黑色素不是一种物质,而是有相同性质的一大类物质。是由苯酚或吲哚氧化聚合而成的大分子。通常产生的黑色素是棕色或黑色，但是也可观察到其他的颜色。2.3.1产黑色素的微生物产黑色素的微生物种类主要是:Bacillus(杆菌)，Pseudomonas(假单胞菌)Azotobacter(固氮菌)。有很多霉菌、细菌、放线菌能生产黑色素，如黑曲霉，它在生成孢子的同时分泌黑色素，所产的黑色素主要有:黑色、红色、黄色,还有极少数是绿色。2.3.2黑色素的应用黑色素的应用潜力十分广泛，如在化妆品或染发剂的装饰作用方面、防紫外线辐射、清除自由基、作为无定形的半导体、以及生物杀虫剂的光保护剂等方面都具有广阔的应用前景。而且,近些年来发现一些可溶性黑色素在体外对爱滋病病毒有显著的抑制作用。2.4靛蓝20世纪初,人们就已经发现假单胞菌能够氧化吲哚合成靛蓝,但其合成机制在当时还不清楚。直到1983年,Ensley等[16]通过对形成靛蓝的有关基因的研究发现,靛蓝的生物合成是在生物体的色氨酸代谢途径中,由色氨酸水解酶和一类可催化芳香族化合物的双加氧酶共同作用的结果。用作靛蓝类色素合成的酶主要是单加氧酶和双加氧酶,它们可以相应地将单个或双个氧原子加入到一个吲哚或吲哚的衍生物分子中。萘双加氧酶是靛蓝生物合成酶中研究最多的1个。Ensley和Choi等均克隆出萘双加氧酶基因,该基因的克隆使吲哚迅速和高效的合成靛蓝成为可能,但产物中常伴有少量副产物靛玉红,因此,转化率和最终产物的纯化阻碍了吲哚生成靛蓝的工业生产。该问题在韩晓红等从荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)中克隆到只催化合成3-羟基吲哚的苯乙烯单加氧酶基因后得到解决。2.5醌类色素蒽醌类色素的生物合成是通过醋酸丙二酸合成途径生成的,可分为2个阶段:蒽醌母核的生物合成和蒽醌母核的后修饰。首先1分子乙酰CoA和7分子丙二酰CoA在聚酮体合酶的作用下生成大黄素甙,大黄素甙通过氧化成环生成初级蒽醌物质大黄素,大黄素再通过不同的修饰途径生成各种蒽醌类产物。3微生物色素遗传工程研究进展微生物色素在生物体内合成的主要化学途径、代谢过程及相关酶基因的克隆,为采用代谢工程技术构建工程菌种和优化色素、合成代谢网络提供了基础。目前国内外已有研究者采用代谢工程手段进行微生物色素菌种的构建和代谢途径的调控,并取得了一定的进展。3.1引入外源基因,构建色素工程菌以不能合成色素但是能在人为控制下快速增殖的大肠杆菌为受体,表达色素的一系列合成酶基因,使其实现合成酶的组成型高效表达,从而获得大量的色素产物。在明确已有生物合成途径、相关基因以及各步反应的分子机制后,通过对相似代谢途径的比较,使利用多基因间的协同作用构建新的代谢途径成为可能。3.2改变代谢途径,促进色素合成可以通过导入微生物色素合成酶基因来改变代谢途径,获得需要的色素。Ruan等将嗜麦芽假单胞菌中产黑色素基因reel克隆到穿梭载体pHT3101中,并将它处于表达系统cry3A的控制下,构建得到重组质粒pHTAM,转入苏云金芽胞杆菌BMB171中,得到重组菌株RSA。研究结果表明,处于cry3A控制下reel基因在重组菌株中得到了成功表达,而且转化子BMB171不仅具有稳定产生黑色素的能力,还可抵抗紫外线的辐射作用,显著提高其杀虫效果。3.3利用遗传修饰,调控色素合成转基因加速了相应酶催化限速反应,促进了相应色素的合成,但同时也可能导致其他代谢途径失衡,发生紊乱。因此若能转入可进行反馈调节的调控子单元,则可以根据代谢中间产物量调控基因表达,减少由于代谢失衡造成的负面影响。美国研究者应用基因剔除技术并结合转基因技术,通过不同的途径获得了菌体番茄红素含量高达18mg/g的菌种。Royo等将双加氧酶基因融合人细菌染色体,建立级联扩增的表达异源基因的表达环路,该级联表达体系可以稳定和高效地表达双加氧酶,持续表达至少5天,可以严格控制和保证靛蓝的稳定生产。4结语自然界中存在大量能够生产色素的微生物,利用基因工程手段得到编码色素合成酶的相关基因,构建微生物色素生产工程菌,并对其代谢途径进行有效调控,有望实现色素的大规模生产。但与合成色素相比,微生物色素产量一般较低,而且有些微生物在发酵过程中会产生部分毒性物质,作为生产菌,这样不仅增加了提纯难度,也增加了投入成本。20世纪70年代发展起来的基因工程技术对微生物细胞色素代谢结构进行调整提供了有力的工具。应用代谢工程技术对工程菌进行改良,一方面使之去除毒性基因,另一方面使之有利于外源基因的高效表达及高密度发酵。外源基因高效表达条件下的高密度发酵对于提高生产效率、降低生产成本、简化产品纯化工艺都具