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哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展生科1202班张文娅201224140212摘要：卵母细胞体外成熟培养已经成为现代胚胎生物技术的重要内容之一，是性别控制、体外受精、核移植和转基因等技术成功前提和关键[1]。关键字：哺乳动物；卵母细胞哺乳动物卵巢内含有大量的原始卵泡，其数量因物种和发育阶段而不同，如出生小鼠大约为一万个，人和家畜约为几百万个。到初情期后，小鼠约四千个，牛羊约十万个，猪约四十多万个，但大部分卵泡中途闭锁退化，在一个生殖周期中发生排卵的卵泡只有一个或几个[2]。所以说，哺乳动物卵巢的开发潜力很大。1卵母细胞的获取卵母细胞体外成熟（invitromaturation,IVM）是指从卵巢中获取未成熟卵，经过适宜的体外培养条件，卵母细胞发育成熟并具有受精和胚胎发育能力。哺乳动物卵母细胞体外成熟质量对卵母细胞的激活、受精及其后继的胚胎发育均有重要影响[3]。获取大量的优质卵母细胞是实现卵母细胞体外成熟培养的先决条件，也是胚胎生物技术研究的基础。1.1活体采集活体卵母细胞的采集主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。20世纪80年代初，Sirard首次将内窥镜用于牛卵泡卵母细胞的采集，同年Copata也以同样的方法获得成功；荷兰Pieterse等首次利用超声波技术通过子宫壁从活牛卵巢采集到卵母细胞。盲采法由熟悉操作的人一只手通过操控采卵器进行阴道弯隆穿刺，另一只手直肠内配合引导采卵器并把握卵巢吸取含有卵子的卵泡液进行取卵[4]。盲采法回收率达65%以上。内窥镜法是在腹腔镜探头的观察下，通过操作杆和采卵针收集卵母细胞的方法。内窥镜法对卵母细胞的回收率达40%-80%，超声波法回收率达60%。盲采法是使用最多的一种方法。活体采集对操作人员的技术要求比较高。1.2离体采集离体采集卵母细胞最大的优势在于取材方便，相比活体采卵技术，显著降低了卵母细胞的获取成本和对操作人员的技术要求，能够满足实验对大批量卵母细胞的需求。一般采用机械分离法，主要有抽吸法、切割法和剥离法。抽吸法是利用注射器直接抽取卵泡液收集卵母细胞，这种方法操作简单，但在抽吸的过程中容易破环卵母细胞表面的放射冠，导致可用卵母细胞率偏低；切割法是先用手术刀片划破卵巢表面的卵泡，再用基础培养液冲洗卵泡腔，收集冲洗液，回收卵母细胞的方法，这种方法容易造成丢卵的现象，剥离法是将卵巢上完整的卵泡取出，放入培养液中，再用手术刀片切开卵泡，使卵泡液流入培养液中，进行集卵的方法[5]。活体采卵与离体采卵法各有其利弊。离体采卵操作简单、卵母细胞获取率高、应用范围更广，目前大部分核移植的供体细胞都是通过离体采卵法获得卵母细胞资源的。2体外培养条件未成熟卵母细胞再体外培养过程中，培养体系是影响其成功的关键因素之一[6]。有研究者通过电子显微镜观察卵母细胞器的变化，卵母细胞与颗粒细胞间连接及信息传递等，结果显示向培养液中添加促性腺激素可明显增加卵母细胞成熟率[7]。另外还可以促进胚胎早期发育[8]。促卵泡素再卵母细胞体外成熟过程中刺激细胞核及细胞质的成熟，并且对于之后的卵裂及囊胚的形成有一定的影响。2.1激素卵母细胞体外成熟培养需要多种激素的参与，除了促卵泡素之外，还有促黄体素、人绒毛膜促性腺激素、雌二醇等。促卵泡素可以诱导卵丘细胞扩散，促进胞质成熟，提高卵母细胞的成熟率。2.2基础培养液基础培养液是卵母细胞体外成熟培养必不可少的，根据来源不同，可将培养液分为人工合成基础培养液和天然基础培养液。使用最多的人工合成培养液是TCM199培养液，而缓冲系以Hepes或碳酸氢盐为好。常用的天然基础培养液有血清、血浆及组织提取液等。血清成分极为复杂，不同血清其成分也有区别。血清内含有激素、生长因子、细胞因子等许多成分。培养液中添加血清可以促进卵母细胞的成熟，血清与卵丘细胞一起能防止透明带变硬，有利于精子的穿入。常用的血清产品有BSA,FCS,FBS,ECS，不同血清使用效果不一样。研究表明，成熟培养液中添加同种动物的血清有利于提高卵母细胞体外成熟率，且发情期血清的效果更优于普通血清。这与动物的种间差异及生殖激素含量多少有关，但其作用机理还需进一步探索研究[5]。2.3卵泡液卵泡液含有大量的生长因子、卵母细胞和卵泡细胞的分泌因子，是卵母细胞体外发育的重要介质。卵泡液可以提高卵母细胞质成熟，并能使卵母细胞获得胚胎发育的能力，提高卵母细胞体外成熟后的囊胚发育率。在卵泡动态发育的过程中，卵泡液的生化组分也发生变化，各种激素的含量会发生改变，生长因子活性发生波动，用于体外成熟培养时可能会出现不同的作用，甚至可能会抑制卵母细胞的成熟。多年来研究者在卵泡液对卵母细胞减数分裂具有抑制作用上已达成共识，并先后在猪、鼠、牛卵泡液中分离获得了卵母细胞减数分裂抑制剂。还有学者认为成熟培养中卵泡液的添加还要考虑到卵母细胞来自的卵泡的大小，这个设想还有待深入研究。3结语经过几年发展卵母细胞体外成熟还存在不少问题。一是如何在体外培养的过程中尽量保持卵子生理结构和功能的完整性；二是在体外成熟培养时如何使核和质发育同步。解决这些问题还需要进一步研究卵母细胞发育的分子调控机制，完善体外培养条件，在培养基添加未成熟卵发育所需的因子及能量物质，并尽早建立一套标准以判断体外培养的卵母细胞的成熟度[9]。卵母细胞的成熟是一个复杂的动态过程，只有深入了解掌握卵母细胞成熟机制，才能更好地利用卵母细胞成熟的规律为现代胚胎生物工程的发展服务。通过对卵母细胞的体外成熟机制的研究，卵母细胞的体外成熟体系将会更加完善，它必将推动核移植、转基因、人类辅助生育等的迅速发展[3]。参考文献[1]郑军军,王士勇,杨月春,等.鹿卵母细胞体外成熟研究进展[J].《特产研究》,2013,2:67-70.[2]张忠诚.家畜繁殖学【M】.北京：科学出版社，2000[3]陈涛,曹鸿国,张卫琴,等.卵母细胞成熟发生机制的研究进展[J].《生命科学》,2009,21(2):307-310.[4]李喜春,王恒.牛卵母细胞体外成熟培养研究进展[J].《中国牛业科学》,2006,32(4):41-45.[5]樊敏欢,许丹宁,田允波,等.羊卵母细胞体外成熟培养的研究进展[J].《畜牧与兽医》,2012,44:41-44.[6]RobertsR,FrankS,HardyK,etal.Cultureenvironmentmodulatesmaturationandmetabolismofhumanoocytes.HumReprod,2002,17(11):2950-6.[7]Sutton-McDowallML,GilchristRB,ThompsonJG,etal.Cumulusexpansionandglucoseutilizationbybovinecumulus-oocylecomplexesduringinvitromaturation:theinfluenceofglucosamineandfollicle-stimulatinghormone,Reproduction,2004,128(7):313-9.[8]洪焱,黄绘,骆荣,等.培养液中添加不同促性腺激素对卵母细胞体外成熟的影响[J].《生殖与避孕》,2011,31(12):833-837.[9]陈雅,叶碧绿.未成熟人卵母细胞体外成熟临床应用研究进展[J].《国外医学计划生育/生殖健康分册》,2006,25(3):134-137.