哺乳动物细胞培养基的基本要求

哺乳动物细胞培养基的基本要求(一)营养成分细胞生长繁殖所需要的营养成分包括氨基酸、单糖、维生素、无机离子和H2O。氨基酸和维生素的添加量是有限的，某些氨基酸和维生素的添加量往往是凭经验的，通常与某个细胞系的建立过程有密切关系。例如，Fisher’s培养基含有高浓度的叶酸，这是因为L5178Y对叶酸的依赖性，在这种培养基的发展过程中，叶酸就被沿用下来了。大多数细胞的培养基都含有葡萄糖作为能量来源，葡萄糖的主要代谢途径是通过无氧酵解产生丙酮酸，丙酮酸可转化为乳酸盐或乙酰乙酸盐，然后进入柠檬酸循环被氧化成CO2和H20。培养基中乳酸的累积在培养胚胎及转化细胞时尤为明显，提示体外培养时柠檬酸循环不能像多细胞机体内那样完全进行。有证据表明，碳源的大部分来自谷氨酰胺而非葡萄糖。这也解释了为何某些培养的细胞对谷氨酰胺和谷氨酸盐的需求异常高。(二)促生长因子及激素促生长因子及激素在商品干粉培养基或液体培养基中一般都不添加，含血清培养液的来源正是血清本身。在无血清培养基中+经常需要添加这些组分。自然凝集的血清，与利用物理方法如离心法去除细胞得到的血浆相比，对于刺激细胞的增殖，效果更好。原因是，自然凝集的血清保留了更多的生长因子，如血小板生长因子。(三)渗透压和pH培养基中基础平衡盐溶液组成的盐类是维持渗透压平衡的主要化合物，这些盐类主要包括Na一、K+、Mg2+、Cl一、SO42-、Ca2+、POi和HCO3-等。大部分培养基的盐浓度是依据Eargle’s和Hank’s平衡盐溶液而来，Eargle’s平衡盐溶液的Hank，s浓度高，适合5％CO2的气体环境。Hank’s平衡盐溶液的HCO3-浓度低，适用于空气环境。5％CO2的气体环境中，培养液的pH稳定及调节依赖于溶解在培养液的CO2气体和组成培养基基础平衡盐溶液的缓冲作用。酚红是常用的pH指示剂，一般培养液中都有添加，pH7．4呈红色，pH7．O变橙色，pH6．5变黄色，而pH7．6呈红色中略带蓝色．pH7．8呈紫色。由于对颜色的观察有很大的主观性，因而建议操作者用无菌平衡盐溶液和同样浓度的酚红配一套标准色标，密封放在与存放培养液相同材质的瓶子中。NaHCO3的浓度取决于气相中的CO2浓度，NaHCO3除了具有pH缓冲能力以外，还有显著的营养作用。Ca2+是某些细胞黏着能力所必需。如在悬浮培养时，减少Ca2+可以减少细胞的聚集和附着。(四)无毒、无污染残留培养液可以直接购买商品培养液，也可在购买商品干粉培养基后自行配制。谨慎使用配制用水是避免细胞毒性二价离子、有毒有机物和微生物污染的关键措施。细胞毒性二价离子一般指ca”、Mg’以外的二价金属离子，它们往往属于微量元素，过量了容易导致细胞中毒，细胞培养时出现诸如细胞生长分裂受阻、细胞坏死、细胞凋亡等现象。保存这些培养液的试剂瓶是否干净无菌也显得非常重要，并且试剂瓶是否在常温下会溶出细胞毒性物质也是选择何种试剂瓶的原则之一。一般建议使用玻璃试剂瓶或无细胞毒性的工程塑料制造的试剂瓶。由于塑料试剂瓶反复使用时容易释放出有害物质，故不建议反复使用。玻璃试剂瓶在反复使用过程中，清洗时尤其注意排除清洗剂残留和金属离子残留。某些清洗剂不宜用于玻璃试剂瓶的清洗，如洗洁精含芳香类有机物、洗衣粉含酶类物质，这些物质在器皿清洗过程中，很难清除彻底，容易导致二次污染。一般建议使用玻璃清洗剂、洗衣皂、去污粉等一类清洁剂。(五)抗生素常用的细胞培养用抗生素中，可以只使用一种，如单一使用庆大霉素或卡那霉素都比较实用便利。多数情况下，抗生素的添加都源于习惯，因此，对于受过专业、系统训练的操作者而言，可以不需要直接添加抗生素到培养液中。换言之，在培养液购买或利用干粉配制液体培养基时，添加抗生素不是必需的，主要依据操作者的熟练程度和操作习惯决定。不建议添加的理由主要有以下几个方面：①无菌操作的客观条件和无菌操作技术日臻成熟，在超净工作台内进行严格的无菌操作，通常不太容易带来微生物污染。②大多数时候，某些抗生素的抗菌谱是有限的，某些环境微生物如果属于抗药菌，则添加的抗生素无效。经常使用某些抗生素，容易诱导产生培养环境的抗药菌。使用某些抗生素对培养细胞的生长与分裂也会产生一定的影响。③抗生素在低浓度下，其生物活性的半衰期更短，需要频繁添加，增加操作难度。④使用抗生素可以掩盖低程度的微生物污染。⑤霉菌和酵母的污染很难使用抗生素控制。在体外细胞培养中使用抗生素，类似于在超净工作台内使用酒精灯作辅助消毒或灭菌一样，不利于掌握严格的无菌操作技术，对于初学者而言，特别提请注意。