外来化合物Zn2对小鼠肝细胞SOD活力的影响

实验十外来化合物的毒性测定——Zn2+（Cu2+或Cd2+）对小鼠肝细胞SOD活力的影响由于工业废水的排放,重金属污染已成为主要的环境污染之一。重金属进入食物链后就在高位营养级和低位营养级之间以吞食和被吞食的方式传递，并在生物体内富集。已有研究表明，锌、铜、镉毒性与氧化损伤密切相关，能促进体内活性氧自由基的产生，使许多组织系统处于氧化应激状态。氧自由基可直接导致蛋白质、DNA及多糖类的结构和功能受损，也可通过使生物膜上的多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化而损伤膜的结构。总之它们通过改变机体的抗氧化系统或膜脂质的过氧化来诱发不同组织的氧化性损伤。在细胞内还存在着清除自由基的体系，主要有SOD,CAT,GSH-Px等。超氧化物歧化酶(SOD)几乎存在于所有动物的细胞中,对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,此酶能清除超氧阴离子自由基(O-2),保护细胞免受损伤,是动物体内一种重要的抗氧化保护酶。一、实验目的本试验以小鼠为试验对象,从锌（铜或镉）毒性的氧化损伤出发,测定染锌（铜或镉）后小鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化,以此探讨锌（铜或镉）对小鼠肝脏抗氧化酶SOD的影响.为细胞分子水平毒性机制探讨和环境安全性评价提供科学依据。二、实验设计的基本原则1重复2随机3对照三、实验仪器、试剂与材料1实验仪器：冷冻高速离心机，分光光度计,天平,恒温水浴锅。2实验试剂：蛋白定量(双缩脲法)试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，预冷的0.9%生理盐水，冰醋酸，预冷的0.25mol/L蔗糖—0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4），5个不同的Zn2+（Cu2+或Cd2+）浓度溶液（400mg/L，200mg/L，100mg/L，50mg/L，25mg/L）。3实验材料：九周龄昆白系小鼠36只，雌雄各半。四、实验步骤1.随机分组：九周龄昆白系小白鼠36只，雌雄各半。适应饲养2d后,随机分成6组，每组6只，雌雄各半。2.染Zn2+处理实验：设置5个Zn2+浓度梯度组(400mg/L，200mg/L，100mg/L，50mg/L，25mg/L)和一个阴性对照组（双蒸水）。各浓度梯度组皮下注射Zn2+溶液0.5mL/小鼠,阴性对照组皮下注射双蒸水0.5mL/小鼠。3.10%肝匀浆粗酶液的制备：皮下注射Zn2+溶液24hr(48hr，72hr，96hr）后，颈椎脱臼处死后，以70％乙醇消毒外部后剖腹取肝，迅速用预冷的生理盐水洗净血水后，用干净滤纸吸干水分，然后称重并将肝剪碎，按每克肝加9ml的冷匀浆介质（0.25mol/L蔗糖—0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4））到玻璃匀浆器中，在冰浴中用玻璃匀浆器制备肝匀浆。在低温离心机中3500r/min离10min，上清液即为10%肝匀浆粗酶液，然后进行蛋白质含量的测定和SOD活性的测定。4蛋白质含量测定：蛋白质含量测定按下表进行操作：空白管标准管测定管蒸馏水/mL0.05––蛋白标准液/mL–0.05–5%肝匀浆/mL––0.05双缩脲试剂/mL2.502.502.50混匀,37℃水浴10min，流水冷却后，于波长540nm，光径1cm，空白管调零，测定各管OD值蛋白质含量的计算公式：蛋白含量mg/ml=测定管OD/标准管OD×蛋白标准浓度(61.5mg/ml)注意：（1）空白管与标准管均一个。（2）检测的蛋白质含量应在1~15mg/ml,若高于此范围,肝匀浆用匀浆介质作适当稀释。5总SOD活力测定：总SOD活力测定按下表进行：试剂测定管对照管SOD试剂一/mL1.001.001%肝匀浆/mL0.02–蒸馏水/mL–0.02SOD试剂二/mL0.100.10SOD试剂三/mL0.100.10SOD试剂四/mL0.100.10混匀,37℃水浴40min显色剂/mL2.002.00混匀，室温放置10min，550nm波长处，光经1cm，以蒸馏水调零，测定各管OD值•总SOD活力的计算公式：•总SOD活力=(对照管OD-测定管OD)/对照管OD÷50%×反应液总体积/取样量ml÷组织蛋白含量(mg/ml)•注意最佳取样量的摸索：10%的肝匀浆，取样量分别为10ul，20ul，30ul，40ul，50ul时，计算(对照管OD-测定管OD)/对照管OD的结果应该在0.15~0.55之间，即百分抑制率在15%~55%之间（此段曲线基本呈直线关系），然后取百分抑制率在48%~50%的一管作为最佳取样量。五、实验结果将所测的SOD活力结果列于下表：SOD活力Zn2+浓度(mg/L)阴性对照2550100200400小鼠个体1小鼠个体2小鼠个体3小鼠个体4小鼠个体5小鼠个体6平均值±标准差六、作业要求本实验为综合设计性实验，为进一步训练学生的科学思维能力和科研写作能力，试验结束后要求每位学生写一篇研究小论文，具体写作格式详见《山西大学学报》自然科学版。山西大学生命科学与技术学院李翠兰E-mail：[e-mail]