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喷雾干燥和冷冻干燥对米渣分离蛋白性质的影响摘要：本课题是为了研究不同的干燥方法对制备大米分离蛋白的效果，希望研究的成果可以为食品工业中植物蛋白的应用提供有用的信息。大米分离蛋白来自米渣蛋白，米渣蛋白是米渣制备淀粉糖浆的副产物，用碱溶液进行大米蛋白的等电点沉淀，随后再用冷冻干燥或喷雾干燥即可得到大米分离蛋白。干燥蛋白必须要仔细研究蛋白的生物化学、物理等和其本身结构的特点。在pH=5~11时，喷雾干燥的分离蛋白与冷冻干燥的分离蛋白相比有着更高的溶解性和乳化性（喷雾干燥的蛋白起泡能力为127.08±2.25%，而冷冻干燥的为118.83±2.71%）。但是冷冻干燥的分离蛋白比喷雾干燥的蛋白有着更高的持水、持油性，更好的热稳定性以及更大的直径（冷冻干燥蛋白直径为2,114.2±79.6nm，喷雾干燥蛋白为490.4±44.8nm）。另外，冷冻干燥的蛋白质含有更多的β-转角蛋白质（冷冻干燥有43.04%，喷雾干燥有25.81%），但却含有更少的β-折叠和无规卷曲蛋白，这表明冷冻干燥蛋白有着更加紧密有序的构想，这也许和它的物理化学及功能性质有关。干燥方法的选择将很大程度上影响分离蛋白的物理化学性质和构想，更进一步将决定其特定的功能性质。对不同干燥方法对蛋白性质的影响研究有助于在食品工业中选择出最合适的干燥方法，使得分离蛋白的利用可以达到最优化。关键词：米渣蛋白大米分离蛋白功能性质物理化学性质喷雾干燥冷冻干燥引言和其他谷物和豆类相比，大米蛋白有着更高的价值，，因为大米蛋白营养价值高，并且有低过敏性质，因此大米蛋白是婴儿奶粉配方中最合适的蛋白质替代物。虽然大米中的蛋白质是所有主要谷物中含量最低的（7%-9%），但大米分离蛋白可以从一些较低价值的物质中提取，如碎米，白垩粒大米，制备大米淀粉的副产物，制备淀粉糖浆的副产物—米渣（蛋白含量50%）。这些物质中提取的大米蛋白有着良好的营养和功能性，因此当作为食品配料使用时，可以最大限度的减少资源的浪费和与之相关的环境污染问题。在食品工业中为了利用大米蛋白，就必须要研究功能性质，探索其是否适合一些食品的使用以及工业化的生产工艺。之前对碱提法的研究是把pH调节到蛋白质的等电点来获得蛋白质沉淀，此法获得的蛋白质和大米胚乳及米糠中的功能性质无异，这是之前文献报道的（ChandiandSogi2007;Paramanetal.2008;Wangetal.1999）。然而，对于不同的工艺方法生产出来的蛋白质功能性质的报道却又有一些矛盾。Wangetal(1990)利用酶法（木聚糖酶、植酸酶、碱混合物）和等电点沉淀的方法从米糠中提取出蛋白质，提取出的蛋白质表现出良好的发泡性和较差的乳化性。然而，在另外一个研究中指出，利用碱法等电点沉淀提取的大米浓缩蛋白却有着良好的持水、持油性和乳化性，但发泡性较差（ChandiandSogi2007）。在这两个研究中，干燥蛋白的方法都是冷冻干燥。另外，Paramanetal.(2008)指出通过超滤、喷雾干燥得到的大米浓缩蛋白与等电点沉淀、冷冻干燥得到的蛋白质相比有更高的溶解性和乳化性。因此，可以说是这些不同的提取、干燥方法形成了蛋白质功能性质的不同。其他因素，如碳水化合物和脂肪也会影响蛋白质的功能性质(Adebiyietal.2007;BoatrightandHettiarachchy1995)。之前已经证明，干燥方法会影响不同生物材料的性质，如：亚麻籽胶(Wangetal.2010)、膳食浓缩纤维(Borchanietal.2011)、大豆壳果胶(Monsoor2005)、亚流感疫苗(Salujaetal.2010)、可食壳聚糖膜(MayachiewandDevahastin2008)、甘薯粉(FaladeandOnyeoziri2012)、鼠尾草油(Sellamietal.2011)、蛋白质水解液(Chenetal.2011)、蛋白质(Joshietal.2011;Tangetal.2003)。然而，不同的干燥方法对大米分离蛋白功能性质的影响却从没有被报道过。通常，干燥蛋白质会通过改变蛋白质结构而使其变性从而减弱蛋白质的压力承受力。在实验研究和蛋白质制药工业中冷冻干燥是最常用的干燥分离蛋白质的方法，而喷雾干燥是在食品工业中制备各种蛋白质粉末时有着很大的重要性，如大豆蛋白，酪蛋白，谷蛋白。因此，本研究的主要课题是系统的比较两种干燥方法对大米分离蛋白的物化、功能、构象等性质的影响，以此来为蛋白质的工业应用提供有用的信息。材料和方法材料米渣（干重60%的蛋白质）江西恒天实业有限公司（中国江西）Termamyl(一种耐热淀粉酶)120L（120KNU-T/g）丹麦诺和诺德公司（丹麦）Viscozyme（复合多糖酶）湖南尤特尔生化公司（中国湖南）1,8—ANS、5，5—DTNB、BSA西格玛奥德里奇公司蛋白质分子量标记仪Fermentas公司（德国）其他化学溶液都是分析纯级别脱脂米渣的制备米渣过100目的筛后的米渣粉，用5倍的石油醚进行脱脂两次、4h，常温下空气干燥。在实验之前，脱脂的米渣粉储存在4°C温度下。大米分离蛋白的制备提取根据Shih和Daigle研究的方法（他们用不同的碳水化合物水解酶去除蛋白质中的碳水化合物，以此来提高蛋白质的含量），我们用酶处理米渣粉（100g）。用0.1g的Viscozyme(50°C,pH6.0,1h)和0.1gTermamyl120L(95°C,pH6.0,1h)水解大米中的淀粉和纤维。然后，把水解后的米渣用去离子水(1:10,w/v)溶解，用1M的NaOH调节溶液的pH为11.得到的溶液在40°C下轻轻搅拌4h，再用离心机5000rpm，离心15min.可以用此步骤重复提取残渣中的蛋白质。提取物的上清液中的蛋白质会在pH=4等电点沉淀（1MHCl,4°C，1h）。离心机在5000rpm，离心15min下得到沉淀物，然后再用去离子水即得蛋白。冷冻干燥冷冻干燥制备大米分离蛋白首先要用蒸馏水以1:1的比例溶解提取出的蛋白质。调节pH到7，在常温下震荡使其均匀。此蛋白溶液在-83°C下预冷，然后再根据仪器FreeZone12-Plus干燥器（LabconcoCorp.,KansasCity,MO,USA）的操作程序在-53°C下冷冻干燥36h.随后干燥的产物即被取出，在4°C下储存以备使用。喷雾干燥要想得到喷雾干燥的大米分离蛋白，要把离心分离得到的蛋白沉淀用去离子水洗涤，然后再1：4的比例下用去离子水溶解。此比例是蛋白质的重量和水的体积之比。然后调节溶液的pH为7，使其均匀，再用旋转喷雾机（MDR.P-5,ModernAtomizingDryEquipmentCo.,Ltd.,Wuxi,China)在进口温度为185°C、出口温度为90°C的条件下对大米蛋白进行喷雾干燥。得到的蛋白粉在4°C下储存以备使用。制备的蛋白和喷雾干燥蛋白混合物（829.8、35.6g/kg,湿基）及冷冻干燥蛋白混合物（795.2、77.8g/kg,湿基）都必须符合AOAC（1990）标准，再利用氮对蛋白质的转换因子5.95来确定蛋白质含量。生化性质十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法分析喷雾干燥大米分离蛋白和冷冻干燥大米蛋白是由Laemmli(1970)提出，该法是在Bio-RadMiniPROTEAN®3体系(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)中，用5%的聚集凝胶和12.5%分离凝胶形成一种连续的缓冲系统。蛋白质电泳带被CoomassieBrilliantBlueR-250染色，同时Pre-stained蛋白分子量标记仪也会作用于相同的凝胶并且用来染色凝胶中蛋白电泳带中的蛋白分子量。对硫基和二硫键的分析根据Beveridgeetal.(1974)的方法知，喷雾干燥大米分离蛋白和冷冻干燥大米蛋白中的硫基水平由使用的Ellman’s试剂决定（此试剂会使蛋白质有一些变性）。简言之，把蛋白质样品放在10ml的磷酸-甘氨酸缓冲溶液（0.086M的磷酸,0.09M甘氨酸,4mMEDTA,pH8.0）中，此溶液含有8M的尿素（全部的硫基）或不含8M的尿素（去除硫基），然后在加入0.1mL的4mg/mL的DTNB.然后再室温下避光搅拌1h，在离心（5000rpm）5分钟。用空白试剂校准零刻度，然后在412nm下测上清液的吸光值。硫基含量可以用下面方程计算得到：μmolSH/g=73.53×A412×D/C（1）方程中的D是稀释倍数（1.01），C是蛋白样品的浓度，A412是蛋白在412nm波长下的吸光值。为了确定S-S基团的含量，把蛋白样品加入到10mL的磷酸-甘氨酸、尿素（10mol/l）缓冲溶液,然后取0.5ml的混合溶液与0.03ml的硫基乙醇混合。在室温条件下反应一个小时，再加入5ml12%的三氯乙酰酸反应1h，然后离心（5000rpm）10min.此洗涤过程要重复两次。向得到的物质中加入3ml的磷酸-甘氨酸、尿素（8ml/l）、0.04ml的DTNB溶液，在室温下避光搅拌反应30min，然后离心（5000rpm）10min，在412nm波长下测上清液的吸光值，S-S基团的含量可以由下面方程计算得到：μmolS-S/g=73.53×A412×D/C-SHTotal（2）其中D是稀释倍数（6.08），C(mg/ml)是蛋白浓度，A412是是蛋白在412nm波长下的吸光值，SHTotal是方程（1）的结果。物理性质差点扫描量热仪是通过利用PerkinElmerPyrisDiamondDSC(PerkinElmer,USA)来工作的，根据AOAC的研究，大米分离蛋白（4~9%）的水分含量由干燥蛋白质（105%）至恒重这一过程所确定。样品的重量测定方法为：把样品（5-8mg）放在一个密封的铝锅中，在30-160°C的温度范围内以每分钟10°C的上升速率升温观察其质量的变化，同时用一个空的铝锅作为对照。为了保证结果的重现性，每组实验做三次。粒径喷雾干燥大米分离蛋白和冷冻干燥大米蛋白的粒径由NICOMP380/ZLS(PSSNicomp,SantaBarbara,CA,USA)测得，然后再用仪器上带有的软件ZPW388分析。制备浓度1%的蛋白用10倍的去离子水稀释，在室温下测量。色散的角度为90°，所得的粒径是平均粒径。表面疏水性喷雾干燥大米分离蛋白和冷冻干燥大米蛋白的表面疏水性的测定要依照Kato和Nakai(1980)两人的方法。Paraman等人在2008年用ANS作为疏水的荧光探针来修饰蛋白。荧光的密度用F-4500荧光测定仪（HitachiCo.,Tokyo,Japan）在波长为390nm（激发）和470nm(散发)下测量。通过线性回归分析得出的荧光密度对蛋白密度的斜率就可以作为表面疏水性的指数。表面张力喷雾干燥大米分离蛋白和冷冻干燥大米蛋白的表面张力是由一台自动表面张力测定仪（JYW-200,Chengde,China)测定。此仪器利用duNoüy环技术，将一铂金环缓慢的从溶液表面提升，测量铂金环脱离溶液表面所需要的力，此时所测得力和表面张力相关。把蛋白溶液（1%,w/v）加入到10mmolpH=7的磷酸缓冲溶液中，然后稀释到20倍制的0.5mg/ml的蛋白溶液，该溶液就是用来测量的溶液。整个实验是在25°C温度下完成。扫描式电子显微镜喷雾干燥大米分离蛋白和冷冻干燥大米蛋白的形态观察要使用仪器Quanta200FSEM(FEI,USA)。把蛋白质样品放在SEM碳涂层棒上，然后用薄层金棒成像，整个成像的过程要20Kv电压来促进。功能性质大米蛋白的功能性质由之前报道的方法确定，如Bera和Mukherjee1989报道的蛋白溶解性，Pearce和Kinsella1978研究的乳化性及其稳定性，Miller和Groninger1976报道的起泡性及其稳定性，Chandi和Sogi2007研究的持水、持油能力。二级结构特点喷雾干燥大米分离蛋白和冷冻干燥大米蛋白的二级结构由傅里叶红外