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1《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。二、实验内容实验一工业微生物菌种筛选根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。1、采样2、增殖培养3、纯种的分离；4、高产菌株的初筛；5、高产菌株的复筛。实验二微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。1、出发菌株的选择；2、同步培养；3、单细胞(或单孢子)悬液的制备；4、诱变处理；5、中间培养；6、分离和筛选。实验三菌种保藏采用合适的方法对实验二所得菌种进行保藏。三、实验要求1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭2他人的数据。四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。3微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。所以微生物的很多工作都是围绕着—个“种”字而进行的。菌种选育包括选种和育种两方面的内容。选种是根据微生物的特性，挑选出符合需要的菌种，一方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索取；另一方面根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，采用各种分离筛选方法，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，在已有的菌种基础上，采用诱变或杂交等方法，迫使菌种发生变异，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。第三当菌种的性能下降时，还要设法使它复壮。最后还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。第一节工业微生物的分离筛选菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤（见图）。一、采样（一）从土壤中采样土壤样品往往是首选的采集目标：土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方；从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤。土壤中微生物分布规律：一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌(108)＞放线菌(107)＞霉菌(106)＞酵母菌(105)＞藻类(104)＞原生动物(103)，其中放线菌和霉菌指其孢子数。在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品：因为各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。1、土壤有机质含量和通气状况4(1)耕作土、菜园土和近郊土壤适合于细菌、放线菌生长。(2)山坡上的森林土适合霉菌、酵母菌生长繁殖。(3)采土样最好的土层是5—25cm。2、土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤(pH7.0一7.5)环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤(pH7.0以下)环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。3、地理条件4、季节条件秋季采土样最为理想。5、采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5—25cm处的土样10—25g，装人事先推备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10一30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3—4g撤到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。（二）根据微生物生理特点采样1、根据微生物营养类型每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生淀粉酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山查等果蔬中合有效多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。2、根据微生物的生理特性筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌，它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘5蔗渣堆积处采样。二、富集培养一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率。可以通过选择性的配制培养基（如营养成分、添加抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。（一）控制培养基的营养成分在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。（二）控制培养条件在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱(pH7.0一7.5)，霉菌和酵母菌要求偏酸(pH4.5—6.0)。因此，富集培养基的pH调节到被分离微生物要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20min，有利于孢子的萌发，可以较大地增加放线菌数目，达到富集的目的。（三）抑制不需要的菌类1、分离细菌时，在培养基中加入浓度为50u／ml制霉菌素，可以抑制霉菌和酵母菌的生长。2、分离放线菌时，在样品中加入0.05％十二烷基磺酸钠(SDS)不仅可以抑制细菌的生长，还能激活放线菌孢子的萌发。加入氟派酸(5mg/L)+制霉菌素(50mg/L)+青霉素(0.8mg/L)也可以有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。3、分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U／ml，可以抑制细菌和放线菌生长。4、分离根霉和毛霉时，由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，难以得到纯化的菌落，通常在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨酸防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。三、纯种分离经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。6（一）稀释涂布法把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等、样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。（二）划线分离法用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌路移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。（三）利用平皿的生化反应进行分离这是一类利用特殊的分离培养基对大量混杂微牛物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。1、透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。(1)分离水解酶产生菌该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选样性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。(2)分离产生有机酸的菌株在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混浊状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。2、变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。3、生长圈法生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围使会形成一个混浊的生长圈。4、抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，使会在该菌落周围形7成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。（四）通过控制营养和培养条件进行分离各种微生物对营养要求和培养条件是不同的，在分离筛选时，若在这两个方面加以调节控制，就能获得更好的分离效果。四、代谢产物鉴别在目的菌株分离的基础上，进一步通过筛选，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株。某些产生菌在分离时就可结合筛选，一般在平皿上通过与指示剂、显色剂或底物等的生化反应直接定性分离，这种方法本身就包含筛选内容的一部分。但并非所有产生菌都能应用平皿定性方法进行分离，而是需要经过常规生产性能测定，即初筛和复筛方能确定。另外，即使已经通过平皿定性反应分离的菌株也需要进一步筛选和更加精确的定量测定。（一）初筛初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。出于菌株多，工作量大，为了提高初筛的效率，通常需要设计一种快速、简便又较为准确的筛选方法。初筛要求筛选的菌株尽可能的多，筛选的菌株越多，就约有希望筛选到所需要的菌株。初筛可以分为两种情况进行：1、平板筛选对那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选比来的菌落，即随机挑选的菌株，由于数量很大，又不知是否具有目的产物的生产能力，这时只能首先采取较粗放的检测方法，如平皿快速检测法。2、摇瓶发酵筛选