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-1-多聚酶链式反应扩增DNA片段学习目标1．了解PCR技术的基本操作2．理解PCR的原理3．讨论PCR的应用学习重点PCR的原理学习难点PCR技术的基本操作课前预习使用说明与学法指导根据学习目标，认真预习课本，用红笔标注重点与难点；15分钟完成课前预习内容。知识准备1.搜集相关知识并阅读2．复习回顾DNA分子的组成成分和结构3．PCR原理：回忆DNA的复制过程教材助读一、基础知识1.多聚酶链式反应的概念：2.多聚酶链式反应的应用：的诊断、、、、和DNA等各方面。3.DNA的两条链是的，通常将DNA的羟基末端称为，而磷酸基团的末端称为。DNA聚合酶不能开始合成DNA，而只能，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是。4.在DNA的复制过程中，复制的前提是。在体外可通过控制来实现。在的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为。PCR利用了DNA的原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。5.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供：，，，，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。二、PCR的反应过程（1）、PCR一般要经历循环，每次循环可以分为、和三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由延伸而成的DNA单链会与结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能，使这段固定长度的序列成指数扩增。（2）、PCR的反应过程变性：在℃时DNA解旋复性：在℃时引物与DNA单链结合延伸：在℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）三、实验操作在实验室中，做PCR通常使用，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在中依次加入各组分，再参照课本P62表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。变性复性延伸-2-四、操作提示（1）、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的、、以及蒸馏水等在使用前必须进行。（2）、PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要。预习自测题1．DNA的3’端是（），5’是（）A．羟基末端B．磷酸基团的末端2.PCR的反应过程叙述正确的是（）A．延伸-----变性-----复性B．延伸----复性------变性C．变性-----复性-----延伸D．变性-----延伸-----复性我的疑问学始于疑（1）什么是DNA的3′端和5′端？（2）DNA聚合酶的特点？DNA的合成方向？（3）如何在体外将DNA双螺旋打开？什么是DNA的变性和复性？（4）PCR怎样控制DNA双链的解聚与结合？（5）怎样解决高温导致DNA聚合酶失活的问题？（6）总结PCR反应所需要的条件。课内探究质疑探究探究一、PCR的反应过程（1）PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为哪三步？（2）在循环之前，常要进行一次预变性，目的是？-3-（3）第一轮循环之后的结果是什么？（4）细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的比较DNA复制PCR扩增不同点场所能量酶是否需要加入引物是否需缓冲液设备相同点原料复制原理模板引物探究二、实验操作1．缓冲液相当细胞内的什么成分？2．（1）在PCR反应中，如何设置对照实验？（2）如果没有PCR仪，可以怎样操作变性、复性和延伸这三个步骤操作提示（1）为避免外源DNA等因素的污染，实验中可以进行怎样的操作？（2）PCR所用的缓冲液和酶应怎样储存？使用前需要经过怎样的处理？（3）在微量离心管中添加反应成分时，应怎样使用枪头？（4）在操作中离心10s的目的是什么？结果分析与评价：（1）利用DNA的什么特点对DNA含量进行测定？（2）DNA含量的测定方法。（3）PCR技术的优点。归纳总结PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。已被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和-4-DNA序列测定等各方面。和DNA复制一样需要模板、原料、能量和酶，但又不完全等同于细胞内DNA复制过程。比如酶，PCR需要耐高温的DNA聚合酶。知识网络图当堂检测1、DNA分子复制时，解旋的两条链中（）A.仅一条链作为复制模板B.两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C.两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子D.两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子2、DNA的合成方向总是（）延伸。A.从DNA分子的左端向右端B.从DNA分子的右端向左端C.从子链的5′端向3′端D.从子链的3′端向5′端3、下列关于DNA复制过程的正确顺序是（）①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构A.①③④②⑤B.①④②⑤③C.①③⑤④②D.③①④②⑤4、要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（）A.氧气的浓度B.酸碱度C.温度D.大气的湿度5、实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（）①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度A.①②③④⑤⑥B.②③④⑤⑥⑦C.②③④⑤⑦⑧D.①②③④⑦⑧课后反思请将学习总结写在下面课后训练1、下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（）①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录A.①②③④⑤B.①②③④C.①②③⑤D.①③④⑤2、DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（）A.模板母链相同B.非模板母链相同多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算-5-C.两条模板母链相同D.两条模板母链都不相同3、利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（）A.2B.4C.8D.164、假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（）A.215B.230C.260D.231