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（独）農業生物資源研究所特待研究員大橋祐子「遺伝子の不活化・活性化を通した植物の生体制御」－101－１．研究実施の概要植物は病傷害に対する独自の自己防御機構を有している。この機構を研究し、遺伝子組換えにより人為的に植物の自己防御力を強化させた植物を作ることが出来れば、それは省農薬・省労力で育つ耐病性・耐ストレス植物となる。このような有用植物は地球環境の保全や食糧増産のために必要であり、その作出に関する基礎研究の進展が期待されている。しかし、外来遺伝子を導入して有用植物を作っても、導入遺伝子が徐々に働かなくなる“遺伝子不活化現象”が頻繁に起こるので問題となっている。また、一度不活性化した遺伝子がまた働くようになる現象も知られている。そこで我々は、この問題を解決するために植物における遺伝子の不活化・活性化の機構を明らかにし、得られた知見を安定した有用組換え植物作出に役立てようと考えた。本研究はこの分野で研究実績のある３グループにより、以下のように課題を分担して行われた。植物における遺伝子の不活性化には、主にプロモーター領域がメチル化される「転写抑制型タイプ（TGS）」と、転写が起こっているのにmRNAが分解される「転写後タイプ（PTGS）」が知られる。大橋グループが植物特有の自己防御機構である過敏感細胞死とこれに伴う誘導抵抗性の機構を“遺伝子の活性化・不活性化”といった点からとらえて研究すると共に、導入遺伝子のPTGSの機構を解析した。角谷グループはDNAのメチル化による遺伝子の不活性化を“メチル化の変異株”を用いて分子遺伝学的に解析し、また、佐野グループは“植物におけるDNAメチル化の機構とその意義を明らかにする”ため独自の系を用いて研究を行った。ここで得られた研究成果は多くの重要新規知見を含み、植物の自己防御機構が個体、組織、細胞のみならず核酸レベルでも巧妙に制御されていることを示した。これらの知見は、外来・内在遺伝子の発現制御技術のみならず、有用組換え植物作出のために役立てられる。［大橋グループ］過敏感細胞死は、病原体に感染した細胞の自殺であり、病原体を感染部位に局在化させ全身に蔓延させないための植物特有の自己防御機構である。この細胞死は、生き残った健全組織を再感染から守るため、植物体全身にさらなる病害抵抗性を誘導する。この全身獲得抵抗性は、高等動物のような免疫系を持たない植物にとって大変重要である。同調的な過敏感細胞死誘導系を用い、細胞死が起こる前にその発現が抑制あるいは活性化される遺伝子の機能解析を行い、過敏感細胞死には、光合成装置である葉緑体が重要な働きをすること、カルモジュリンが誘導抵抗性に関与することなど、多くの新規知見を得た。また、全身抵抗性誘導のシグナル物質とされるサリチル酸が、PTGSを誘発させることでウイルス核酸の特異的分解を促進しウイルス抵抗性を誘導すること、を発見した。さらに、いままでPTGSがその植物当代限りの現象で後代には伝わらないことの原因は“減数分裂ないしは受精などの特定のステージで解除される”ためと言われていたが、実は“PTGSは細－102－胞分裂によってリセットされ、種子では生殖細胞に分化する以前に行われていた活発な細胞分裂によってPTGSがすでに解除されており、PTGSが伝えられる前に親細胞から隔離されるために、次世代にPTGSが伝わらない”ことを示した。［角谷グループ］DNAメチル化を伴う遺伝子不活性化を解除するシロイヌナズナ突然変異ddm1（decreaseinDNAmethylation）を用いて、植物におけるDNAメチル化と遺伝子不活性化の役割を調べた。この突然変異下で誘導される発生異常を遺伝解析することにより、ddm1突然変異下で特異的に転移するトランスポゾンCAC1と、この突然変異下で異所的に発現して発生異常を引き起こす遺伝子FWAを同定した。これによって、DNAメチル化を伴う遺伝子不活性化が、植物遺伝子の適切な発現を保証するだけでなく、トランスポゾンを抑制することによりゲノム構造の維持にも貢献することが明らかにできた。現在この研究は、遺伝子不活性化に影響する種々の突然変異や遺伝環境におけるCAC1とFWAの活性解析へと進展している。これらの研究によって、「epigeneticな遺伝」（塩基配列の変化を伴わない染色体情報の遺伝）の「ゲノム防御」と「個体発生」における役割の分子レベルでの解明を達成しつつある。［佐野グループ］高等動植物のDNAは修飾塩基として5-メチルシトシンを含む。その量は高等植物では全塩基の3-7％に及ぶ。生理作用にはまだ不明の所が多いが、主に遺伝子の発現調節に関与し、植物の自己防御に働いている可能性が指摘されている。ここでは“DNAメチル化の生理作用”を総合的に理解するために、以下に示すような課題をたて多くの成果を得た。（1）緑藻の葉緑体の母性遺伝のしくみの解析：DNAのメチル化により制御されていることを証明、（2）植物からの３種のDNAメチル化酵素遺伝子の単離とその特性解析、メチル化DNAの生理機能解析、（3）環境変化に応答したDNAメチル化レベルの変動と遺伝子発現制御、（4）DNAメチル化の人工操作による有用植物の分子育種。これらの結果は、最近、注目を集めているepigenetic遺伝の植物における実態を明らかにしたもので、角谷グループの成果とあわせ、実用的な分子育種にも応用可能な重要な知見を含んでいる。２．研究構想大地に根を張って生きる植物は、野外での病虫害の攻撃、風雨・傷害などの過酷なストレスを克服して生きてきた。このストレス応答の機構こそ、地上に生き残るための植物の重要な自己防御のしくみと考えられるが、植物には高等動物の持つ病原体や異物の侵入から身を守るための高度に発達した免疫系が欠落している。そこで、これに代わる植物の自己防御のしくみを調べ、ここで得られた知見や遺伝子を利用して植物の自己防御力を強化させた遺伝子組換え植物を作ることができれば、これらは省農薬・省労力で育つ耐病性・－103－耐ストレス植物として国民から歓迎されるものと考えられる。しかし、遺伝子組換え植物作出にあたって、当初働いていた導入遺伝子が働かなくなる、すなわち遺伝子の不活化（genesilencing）が頻繁に起こることが問題となっている。そこで、本課題では、“植物の自己防御のしくみを調べる”とともに、導入遺伝子の不活性化を如何に抑えてその安定な発現を保証できるか、その方法を開発するため、“植物における広義の遺伝子の不活性化と活性化の機構”を研究する。これらの研究は、個体、組織、細胞、核酸レベルでの植物の自己防御機構に関して新たな基礎知見をもたらすものであり、かつ応用的にも重要である。以上は研究開始時に目指した目標であるが、その後の展開から、“耐病性、ストレス耐性モデル植物作成”など当初の計画を上回る目標も設定され、実行された。研究分担は当初の計画通りで、順調に研究が進められた。研究分担：大橋グループは、植物の自己防御の機構を病傷害ストレス応答に焦点をあてて解析すると共に、導入遺伝子の不活性化と再活性化の機構を組換えタバコをモデル植物として調べる。また、耐病性・耐ストレス組換え植物作出を試みる。角谷グループは、DNAメチル化に関するシロイヌナズナ変異株中で誘発される発生異常を連鎖解析するという独自のアプローチを用いて、遺伝子の不活性化を介した植物のストレス応答機構を含め、DNAメチル化による遺伝子発現制御の機構を分子遺伝学的手法により解析する。佐野グループは、植物におけるDNAメチル化の意義を総合的に理解するため、緑藻を用いた葉緑体の母性遺伝の機構や植物のDNAメチル化酵素遺伝子の網羅的単離とその特性を調べる。また、環境変化によるDNAメチル化の変動を解析すると共にDNAメチル化を利用した分子育種の可能性を探る。－104－３．研究実施体制(1)体制研究代表者 大橋グループ農業生物資源研究所 遺伝子不活化の分子遺伝学的解析植物の自己防御機構の解析DNAメチル化による遺伝子発現制御病・傷害応答機構と導入遺伝子不活化機構シロイヌナズナを用いた遺伝子不活化に関与する変異株の解析環境ストレス応答における遺伝子発現制御緑藻クラミドモナスを用いた ゲノミックインプリンテイング機構DNAメチル化制御による分子育種大橋祐子佐野グループ奈良先端科学技術大学院大学角谷グループ国立遺伝研究所遺伝子の不活化・活性化を通した生体制御遺伝子教育センター総合遺伝研究系大橋チーム橋本・菊池チーム４．研究期間中の主な活動(1)ワークショップ・シンポジウム等年月日名称場所参加人数概要2000.11.16-11.17NIAR-COE/BRAIN/CRESTInternationalSymposium“Self-defensesignalingpathwaysinplants”TsukubaInternationalCongressCenter260名口頭発表20ポスター発表46遺伝子の不活化・活性化を通した生体制御DNADNA－105－５．主な研究成果(1)論文発表（国際61件）大橋グループ1.Niki,T.,Mitsuhara,I.,Seo,S.,Ohtsubo,N.andOhashi,Y.(1998).Antagonisticeffectofsalicylicacidandjasmonicacidontheexpressionofpathogenesis-related(PR)proteingenesinwoundedmaturetobaccoleaves.PlantCellPhysiol.39,500-507.2.Yamakawa,H.,Kamada,H.,Satoh,M.andOhashi,Y.(1998).Spermineisasalicylate-independentendogenousinducerforbothtobaccoacidicpathogenesis-relatedproteinsandresistanceagainsttobaccomosaicvirusinfection.PlantPhysiol.118,1213-1222.3.Okamoto,M.,Mitsuhara,I.,Ohshima,M.,Natori,S.andOhashi,Y.(1998).EnhancedexpressionofanantimicrobialpeptidesarcotoxinIAbyGUSfusionintransgenictobaccoplants.PlantCellPhysiol.39,57-63.4.Ohshima,M.,Mitsuhara,I.,Okamoto,M.,Sawano,S.,Nishiyama,K.,Kaku,H.,Natori,S.andOhashi,Y.(1999).EnhancedresistancetobacterialdiseasesoftransgenictobaccoplantsoverexpressingsarcotoxinIA,abactericidalpeptideofinsect.J.Biochem.125,431-435.5.Mitsuhara,I.,Malik,K.A.,Miura,M.andOhashi,Y.(1999).Animalcell-deathsuppressorsBcl-xLandCed-9inhibitcelldeathintobaccoplants.Curr.Biol.9,775-778.6.Ito,N.,Seo,S.,Ohtsubo,N.,Nakagawa,H.andOhashi,Y.(1999).Involvementofproteasome-ubiquitinsysteminwound-signalingintobaccoplants.PlantCellPhysiol.40,355-360.7.Seo,S.and