四目的基因的检测与表达产物的测定

四目的基因的检测与表达产物的测定基因工程的概念基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。目的基因供体细胞受体细胞获得新性状基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将表达载体导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定为什么非要有载体和目的基因一同进入受体细胞呢？研究发现，单个基因或DNA片段导入另一生物体的细胞后，往往会被细胞内的防御系统消灭掉，这样就大大降低了目的基因的表达效率；如果把目的基因包装一下，就很容易逃过受体细胞的防御系统，免遭“灭顶之灾”。基因工程：把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。前面三个步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。标记基因的作用在于便于检测目的基因的情况。因为标记基因和目的基因同位于运载体上，要导入都导入，要表达则都会表达。一般标记基因的DNA序列是已知的，若选用抗氨苄青霉素基因，则可在目的基因导入后用氨苄青霉素来处理受体细胞，若无异常，则抗氨苄青霉素已合成，说明基因已得到表达。标记基因目的基因启动子终止子复制原点2.基因表达载体的组成基因工程的概念把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。目的基因的获得供体细胞基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞获得新性状筛选含有目的基因的受体细胞目的基因在受体细胞中是否转录是否翻译出相应的蛋白质1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。——DNA分子杂交检测方法是：采用DNA分子杂交技术。先将转基因生物的基因组提取出来；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。两种生物的互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链。即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针与转基因生物的目的基因杂交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置能看到），则说明目的基因已经插入受体细胞的染色体DNA中。基因探针：是一小段单链的DNA或RNA,带有放射性同位素标记，并能与目的基因的一条链碱基互补配对2.检测目的基因是否转录出了mRNA这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。——分子杂交采用DNA与RNA分子杂交技术。从转基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mRNA。3.检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗进行同位素标记）进行抗原——抗体杂交；如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否具有了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，观察害虫的存活情况或植物的患病情况以确定是否具有抗性及抗性的程度。又如：有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能中否与天然产品相同，甚至超过天然产品。2.形态检测:检测转基因生物是否表达出相应的性状——目标性状或标记基因的性状1.分子检测2.形态检测:①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质检测转基因生物是否表达出相应的性状——目标性状或标记基因的性状——DNA分子杂交——分子杂交——抗原-抗体杂交目的基因的检测与鉴定——检查是否成功归纳步骤①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因DNA与DNA杂交②检测目的基因是否转录出了mRNADNA与RNA杂交③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交检测抗虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金芽孢杆菌中提取毒蛋白，注入某种动物体内，从动物的血清中分离出相应的抗体，并用荧光标记该抗体，然后用标记的抗体与抗虫棉的细胞提取液混合，如出现杂交带，则表明抗虫基因已经在棉花细胞中表达。归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR技术人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法；显微注射法；氯化钙法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。2.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？思考与探究（2012福建）32．现代生物科技专题肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图１。（１）进行过程①时，需用__________酶切开载体以插入let-7基因。载体应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let-7基因转录，该部位称为。限制性核酸内切酶（或限制）_启动子“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。（2012福建）32．现代生物科技专题肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实验表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图１。（２）进行过程②时，需用酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。胰蛋白“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。（３）研究发现，let-7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图２。据图分析，可从细胞中提取进行分子杂交，以直接检测let-7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞（RASmRNA/RAS蛋白）含量减少引起的。RNARAS蛋白“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。（5）基因工程中除质粒外，和也可作为运载体。（4）反转录作用的模板是，产物是。若要在体外获得大量反转录产物，常采用技术。（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是mRNA（或RNA）cDNA（或DNA）噬菌体未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱PCR动植物病毒等（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。30.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。请据图回答：（1）A过程需要的酶有__________________________。（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。限制性内切酶和DNA连接酶具有标记基因；能在宿主细胞中复制并稳定保存“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入_________。（4）如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用作为探针。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。卡那霉素放射性同位素（或荧光分子）标记的抗虫基因“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。①将转基因植株与__________________杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。非转基因植株“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。②若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为_______。3:1“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2012年1月15日，汉水丑生标记。（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。③若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占____%。100练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）aa练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国