大肠杆菌R基因克隆载体的构建与鉴定

1大肠杆菌R基因克隆载体的构建与鉴定[摘要]DNA的重组与转化是分子生物学的基本实验操作。本实验可分为质粒DNA提取与鉴定，目的片段扩增与鉴定，DNA重组与转化三部分。本次实验可以全面提高学生的实验技能与逻辑思维，对于分子实验技能的培养具有重要意义。[关键词]DNA重组；转化；分子实验基本操作大肠埃希氏菌是常用的实验菌种，其质粒R-pGEX-4T-1为人工设计，已加入R目的基因片段。现需要将R基因转到pMD18-TSimpleVector载体质粒上，并将目标质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，并检验转化效率。1
材料与方法1.1材料1.1.1
菌株及质粒E.coliDH5α；R-pGEX-4T-1质粒；pMD18-T载体。1.1.2主要试剂和仪器溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，TE缓冲液，0.5MEDTA，5*TBE，氯仿:异戊醇（V:V，24:1），70%乙醇，50mg/mLCarb，10*loading-buffer，2.5mmol/LdNTP混合物，Taq酶，DNA模板，引物对，10*PCRbuffer，50*TAE，0.1MCaCl2溶液，LB固体/液体培养基，5mg/mlTet，34mg/mlCam，3MNaAC，10mg/mLX-gal，200mg/mLIPTG（以上常规试剂全部按照《分子生物学实验指导》要求配制）；恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，凝胶成像仪，琼脂糖凝胶电泳系统，PCR热循环仪，低温离心机，超净工作台。1.2方法1.2.1质粒DNA提取向含Carb（100μg/mL）的LB液体培养基中接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。质粒DNA用碱裂解法制备，具体步骤参照《分子生物学实验指南》。用1％琼脂糖凝胶电泳验证质粒提取结果。1.2.2质粒DNA双酶切及鉴定运用XhoⅠ酶与EcoRⅠ酶对上述步骤中提取的质粒R-pGEX-4T-1进行双酶切，酶切反应体系参见表1（如下），37℃反应1.5小时。并用1％琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果。1.2.3目的DNA片段的扩增与纯化根据质粒R-pGEX-4T-1的序列，设计一对2R基因引物（表2）用于R基因的扩增。PCR反应体系以质粒DNA为模板，用25μL反应体系进行扩增（表3），反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40sec，55℃退火50sec，72℃延伸50sec，重复30个循环，72℃延伸8min。PCR产物经琼脂凝胶电泳图像分析鉴定,并按照胶回收试剂盒步骤，割胶纯化，回收PCR产物，-20℃低温保存。表1酶切反应体系表3PCR反应体系表2扩增R基因所用引物1.2.4DNA重组与转化用CaCl2处理大肠杆菌，制备感受态细胞，具体步骤参照《分子生物学实验指南》。按照表4构建连接重组体系，16℃连接反应30min，制备重组质粒。将5μL连接产物加入至200μLDH5α感受态细胞中，冰中放置30min；热激，恢复性培养后去上清涂布于含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基，倒置平皿37℃培养过夜（12～16h），形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。表4质粒连接重组体系pMD18-TSimpleVector（50ng/μL）0.5μLInsertDNA（0.1pmol～0.3pmol）3μLddH2Oupto5μLLigationMix5μL总体积10μL2结果2.1质粒DNA提取结果鉴定2.1.1质粒提取后，1％琼脂糖凝胶电泳。（实验结果图缺失）反应物体积（μL）10×PCR缓冲液2.525mmol/LMgCl21.52.5mmol/LdNTP2引物11.5引物21.5TaqDNA聚合酶0.2模板DNA(1ng/μL)2加ddH2O至25μL13.8EcoRⅠ1μLXhoⅠ1μL10×HBuffer2μL质粒DNA8μL≤1μg无菌水8μL总体积20μL（无菌水补至总体积）引物引物序列扩增长度15’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’25’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’600bp32.1.2质粒双酶切二次鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳（如图一）显示出特异性条带说明质粒中确含有R基因，质粒提取成功。M：DL2000maker；1：双酶切结果产物M：DL2000maker；1：R基因PCR产物图一质粒R-pGEX-4T-1双酶切鉴定结果图2R基因PCR鉴定结果2.2目的DNA片段的扩增鉴定用所设计的引物对目的片段R基因进行克隆，得到R基因（600bp）（如图二）条带清晰、亮度高，证明PCR结果较为理想。2.3DNA转化结果鉴定本部分实验结果不成功，培养基表面涂花，无单菌落长出。3讨论细菌质粒的获取，与DNA重组与转化，是分子生物学的基本实验操作。在本次实验中。成功实现了质粒DNA的提取与鉴定，目的基因的克隆与鉴定，细菌感受态细胞制备与质粒DNA重组与转化。在实验中，也有操作不理想之处。分析DNA转化鉴定没有结果的原因，有以下几点：○1Amp可能加入过早，未待平板冷却，导致加入的Amp失活，故没有Amp抗性的培养基上长满了菌，而不出现白色的单菌落；○2烧热的涂棒未冷却便进行菌液涂布，导致培养基表面融化；○3菌液未充分混匀，平板菌落分布不均等。[参考文献][1]魏群，2007.分子生物学实验指导.高等教育出版社.75—96[2]高小焕，邵世和，段秀杰，谢立苹，2011.幽门螺杆菌IV型分泌系统cagX基因缺失株的构建与鉴定.江苏大学学报（医学版），21（2）：117—121