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一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。2.掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA的原理。二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来DNA分子的本质看法不一。主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322质粒DNA对E・coliK――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/LCaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。（二）重组DNA的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk-mk-rec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。因pUC18带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pUC18DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pUC18上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E.coliDH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pUC18和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pUC18和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段TGFβⅠ插入到pUC18质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。DNA分子转化的原理较复杂：1、吸附――完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面。2、转入――双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解。3、自稳――外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。4、表达――供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。对DNA分子来说，能被转化进受体细胞的比率极低，通常只占DNA分子的0.01%，改变条件，提高转化率是很有可能的，一些研究表明下列因素可以提高转化率：（1）受体菌细胞与DNA分子两者比例在1.6×108细胞：1毫微克DNA分子（4.3Kb）左右转化率较好；（2）DNA分子与细胞混合时间为1小时最佳；（3）铺平板条件会影响转化率；（4）对不同转化菌株热处理（效应不一致）。除上述因素外，转化试验还注意如下问题：1、连接DNA反应液与受体细胞混合时，一定保持在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率将极差。2、热处理2分钟后，要迅速加进1毫升LB以使表型表达，延迟加LB，将使转化率迅速降低。3、在平板上涂布细菌时。注容避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械压涂布将会使细胞破裂。影响转化率。三、材料（一）仪器与器皿恒温振荡器分光光度计电动沉淀离心机旋涡混合器恒温培养箱隔电热恒温水浴锅恒温摇床普通冰箱Eppendorf管转液管平皿涂布棒微量取样器微波炉三角烧瓶试管刻度离心管保温瓶酒精灯等（二）菌种大肠杆菌C600或DH5α（rkrecmk）（三）培养基与试剂1.LB液体培养基（1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaClpH7.5。）2、100mmol/LCaCl23.氨苄青霉素溶液（50毫克/毫升）4.DNA连接反应液5.X-gal储液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。6.IPTG储液(200mg/ml):在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。7.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板。8.含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收，备用。四、实验步骤（一）大肠杆菌感受态细胞制备1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化，置于恒温培养箱中37℃培养过夜。2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3毫升LB试管中，于恒温振荡器上，37℃振荡培养过夜（约16小时），必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致，有无杂菌污染。3、用移液管无菌条件下，取过夜培养液1毫升，接种于新鲜的LB中（100毫升LB/250毫升三角瓶，接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右），于恒温振荡器上37℃培养2―3小时。4、取1毫升培养液以未接种的LB作空白对照，在751分光光度计上测OD550的光密度值，约为0.2―0.5左右。5.无菌条件下将上述1毫升菌液倒入1.5毫升EP离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过），每组2支。6、带菌液的离心管置于冰上10分钟，冷却菌液，平衡好，置于台式低速离心机上，3500r/min离心5分钟。7、无菌条件下，倒去上清LB，倒斜离心管，让LB流干，留下沉淀菌体，加入预冷的100mmol/LCaCl2溶液600微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2支管转为1支，摇匀后于冰浴中放置30分钟。8、重新将CaCl2菌悬浮液置于台式低速离心机上，3500r/min离心10分钟，小心侧倒掉上清CaCl2，留沉淀菌体。9、再把菌体悬浮在200微升100mmol/LCaCl2的溶液中，置于冰上作为转化的受体菌液。此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用，效率比较高。10.在事先制备好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收，备用。（二）重组DNA转化1.取0.2ml大肠杆菌感受态细胞，在无菌条件下，加入到连接液的Eppendorf管，混匀，置冰浴中30分钟。2.冰浴后，将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的的恒温水浴槽内，保温2分种。3.热冲击处理后的细胞易死亡，应迅速倒入LB培养液1毫升，（无抗菌素LB液，有助于基因表达）马上置37℃水浴1小时，每10分钟翻转1次。4.用移液器取0.1毫升的转化菌液直接涂布含50μg/mlAmp、40mlX-gal储液和4μlIPTG储液LB固体平皿上，共涂布三个培养皿。5.用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40mlX-gal储液和4μlIPTG储液LB固体平皿上，作为受体菌对照。6.将第14、15步涂布培养皿先放室温15分钟左右，使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中37℃培养过夜。7.第二天取出培养皿，观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对Amp敏感，故不能在含Amp的培养基上生长。转化平皿是否有兰色和白色菌落生成？如果长出兰色菌落，说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌，但目的基因没有接入载体。如果长出白色菌落，说明目的基因已接入载体，重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。五、结果和讨论比较对照平皿和转化平皿，讨论转化成败原因.